蛇毒抗肿瘤应用及其机制的研究进展*

黄秒 综述 胡启平 审校

·综 述·

蛇毒抗肿瘤应用及其机制的研究进展*

黄秒①综述 胡启平②审校

蛇毒对多种恶性肿瘤细胞有抑制增殖、诱导细胞凋亡和（或）抑制细胞迁移等作用，且呈剂量效应和（或）时间效应关系；此外，蛇毒还具有抗肿瘤血管生成作用。蛇毒抗肿瘤机制如下：1）通过阻断某些信号通路抑制肿瘤转移；2）通过激活死亡信号通路诱导肿瘤细胞凋亡；3）通过调节抑（促）癌基因表达或阻滞细胞周期抑制肿瘤细胞生长和增殖；4）通过抑制肿瘤细胞表达血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）而抑制肿瘤血管生成。蛇毒在抗肿瘤应用方面具有较大的发展空间。本文对近年来国内外蛇毒抗肿瘤应用相关文献资料进行整理和归纳，总结了蛇毒抗肿瘤作用及其机制，以期为蛇毒抗肿瘤成分的研究、开发和应用提供参考。

蛇毒 抗肿瘤 机制 增殖 迁移 凋亡 血管生成

蛇毒是从毒蛇的毒腺中分泌出来的一种毒液，是最复杂的天然毒性蛋白混合物之一，含有蛋白质、多肽、酶类及其他小分子物质等多种活性成分。随着药理学、生物化学、分子生物学的发展，蛇毒的多种活性成分的研究越来越深入，发现蛇毒组分在抗凝［1-2］、镇痛［3］及抗肿瘤方面具有良好的作用。大量研究报道，蛇毒组分可抑制血管生成［4-5］，对人肝癌［6-7］、乳腺癌［8］、肺癌［9］等10余种肿瘤细胞具有促进凋亡、抑制增殖、抑制迁移［10］等一种或多种作用和效应。本文对近年来国内外实验中蛇毒组分在抗肿瘤方面的应用及机制的研究进展进行综述。

1 蛇毒抗肿瘤效应

1.1 蛇毒对肿瘤细胞的影响

1.1.1 蛇毒对肿瘤细胞迁移的影响 一些蛇毒蛋白如agkihpin，是一种从江浙蝮蛇（Agkistrodon halys pallas）蛇毒中提纯的精氨酸酯酶，可抑制人肝癌细胞和鼻咽癌细胞的迁移。用不同浓度的agkihpin处理肝癌细胞株后，应用MTT法检测肿瘤细胞活力，应用细胞计数法检测agkihpin对细胞迁移的影响。结果显示,0.207～4.130mg/L剂量的agkihpin对人肝癌SMMC-7721细胞的迁移有明显的抑制作用，抑制率可达7.8%～98.0%，剂量越大抑制作用越明显［11］。

1.1.2 蛇毒对肿瘤细胞增殖和细胞周期的影响 一些凝集素、半胱氨酸蛋白酶抑制剂（snake venom cys-tatin，sv-cystatin）、L-氨基酸氧化酶（NA-LAAO）等蛇毒蛋白或多肽可抑制肿瘤细胞增殖、阻滞肿瘤细胞周期。Jebali等［12］研究发现，地中海钝鼻蝰蛇（Macrovipera lebetina）毒中C型外源凝集素lebecin对乳腺癌细胞MDA-MB231的增殖具有明显抑制作用，且呈时间及剂量依赖性，并可抑制MDA-MB231细胞依赖于纤维蛋白原和纤连蛋白的迁移。齐元麟等［13］研究发现转染中华眼镜蛇（Naja naja actra venom,NNAV）蛇毒中sv-cystatin基因后，在体内外实验中均对小鼠黑色素瘤细胞B16F1增殖具有抑制作用；NA-LAAO可使人膀胱癌细胞株ECV304细胞阻滞在G1期，并呈量-效关系，同时NA-LAAO对ECV304细胞的生长还有强烈抑制作用，且呈量-效和时-效关系［14］。李映新等［15］发现尖吻蝮蛇（Agkistrodon acutus）毒小分子多肽组分对人卵巢癌细胞株A2780的增殖有抑制作用并呈明显的时-效及量-效关系。

卢康荣等［16］研究发现11种眼镜蛇毒组分对体外培养的神经胶质瘤细胞U251均有不同程度的生长抑制作用，其中组分KDⅡ-3对肿瘤细胞的抑制作用呈现剂量和时间依赖性。KDⅡ-3还使U251的细胞周期阻滞在G0/G1期，从而抑制U251细胞的增殖。此外，采用7.5 mg/L KDⅡ-3处理U251细胞24 h后，显示细胞膜皱缩，染色质浓缩、碎裂，透射电镜观察显示细胞核固缩，染色质凝聚。

1.1.3 蛇毒对肿瘤细胞凋亡或坏死的影响 一些蛇毒组分可诱导肿瘤细胞凋亡或杀伤肿瘤细胞，如细胞毒素、凝集素等。王艳等［17］发现眼镜蛇毒细胞毒素CTX具有较强的毒性作用，在体外可以诱导人肝癌BEL-7404细胞凋亡，且具有明显的量-效、时-效关系。Aranda-Souza等［18］研究发现，从巴伊亚盾头蝮蛇（Agkistrodon acutus Bahia）毒提取的凝集素能加快黑色素瘤细胞B16-F10的细胞凋亡。一些粗毒或抑瘤组分对癌细胞有强效杀伤作用或促进凋亡作用，如Song等［19］研究发现，蝰蛇粗毒对卵巢癌PA-1和SK-OV3细胞的增殖有抑制作用，诱导卵巢癌细胞凋亡；Zhang等［20］以眼镜蛇毒提取物ACTX-6对肺癌A549细胞、周兵等［21］以尖吻蝮蛇毒提取物AAVC-I对小鼠肺癌LLC细胞进行体外实验，均证实蛇毒组分对肺癌细胞有强效杀伤作用；郑汝琦等［22］选择人慢性髓系白血病K562细胞株为实验对象，发现尖吻蝮蛇毒抑瘤组分1（AVVC-1）可以诱导K562细胞发生凋亡，并由此发挥其抗肿瘤活性。

1.1.4 蛇毒对肿瘤细胞的综合影响 一些蛇毒蛋白组分对肿瘤细胞的作用包括抑制增殖、诱导凋亡和（或）抑制迁移等多方面。100 μg/mL蛇毒金属蛋白酶bothropoidin处理人乳腺癌MDA-MB-231细胞24 h后，30%癌细胞被杀灭；10、40 μg/mL的bothropoidin均对细胞早期凋亡和晚期凋亡有明显的促进作用。此外，这种毒素不仅以剂量依赖方式抑制MDA-MB-231细胞的黏附，还使细胞迁移能力下调45%［4］。NNAV组分对乳腺癌MCF-7细胞增殖具有明显的抑制作用，且呈时间及剂量依赖性，NNAV处理后细胞出现形态不规则，部分细胞变圆甚至脱落、细胞破碎等改变，且可以诱导细胞凋亡［23］。Sv-cystatin重组蛋白体外实验，可在转录水平和蛋白水平下调人肝癌MHCC97H细胞转化生长因子-β2、肿瘤坏死因子α的表达，从而发挥多方面的抗肿瘤作用［24］。Agkihpin可通过下调多药耐药蛋白1、环氧合酶2表达及上调表皮钙黏素表达来抑制人肝癌SMMC-7721细胞［25-27］的活力、增殖和迁移。沙漠眼镜蛇（Walterinnesia aegyptia）毒MEV与二氧化硅纳米粒子NP联合（MEV+NP）体内外均能持续有效抑制乳腺癌、前列腺癌、多发性骨髓瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡［27］。NNAV在体外可明显抑制白血病K562/ADM细胞和原代初发难治性急性髓性白血病细胞增殖，并诱导细胞凋亡［28］。

1.2 蛇毒对肿瘤血管生成的影响

肿瘤的生长和转移依赖于血管生成，内皮细胞的侵袭和迁移是调节肿瘤进展的主要方式。Bothropoidin可降低内皮细胞的活力和黏附性，抑制碱性成纤维细胞生长因子诱导的体外血管生成，表明bothropoidin具有抗血管生成作用［4］。蛇毒去整合素lebein降低P53依赖性结肠腺癌LS174细胞黏附和迁移，并抑制VEGF诱导的鹌鹑胚胎CAM系统中新生血管形成，阻断裸鼠中人结肠腺癌的发生［29］。Jang等［30］报道蛇毒去整合素saxatilin抑制人肺癌细胞NCI-H460的血管生成特性。NCI-H460细胞培养上清液能够诱导人脐静脉血管内皮细胞侵袭和血管形成，而saxatilin处理的癌细胞培养上清液的血管生成活性被削弱。Markland等［31］发现南部铜斑蛇（Agkistrodon contortrix）毒去整合素contortrostatin（CN）可有效阻断人卵巢上皮癌OVCAR-5细胞黏附于多种细胞外基质蛋白，并抑制肿瘤细胞通过人工基底膜；进一步对OVCAR-5荷瘤小鼠模型进行肿瘤扩散和抗血管生成作用研究，发现腹腔注射CN不仅显著抑制裸鼠卵巢癌的扩散，而且显著地防止了继发部位肿瘤血管的招募。

2 蛇毒组分抗肿瘤的机制

2.1 通过抑制Wnt/β-catenin通路来抑制肿瘤细胞的转移和侵袭

本课题组通过实时定量PCR、Western blot、生物信息学技术和酶活性分析研究发现，agkihpin可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路介导的上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）来抑制肝癌细胞的转移和侵袭。EMT是癌转移和侵袭的起始步骤和主要表型，agkihpin作用后肝癌细胞SMMC-7721和HepG 2中上皮细胞标志物E-cadherin表达上调，间质细胞标志物N-cadherin和Vimentin、转录调节因子Snail和twist表达下调，表明agkihpin可逆转EMT；经典的Wnt/β-catenin通路是EMT的起始信号之一，agkihpin作用后肝癌细胞中FZD7和β-catenin表达下调、GSK3β（Ser9）磷酸化和β-catenin核沉积减少，从而使Wnt/β-catenin通路抑制。因此，本课题组提出假说，agkihpin通过降解FZD7抑制Wnt/β-catenin通路，导致TCF/LEF转录因子失活，进而使EMT逆转，最终减弱肝癌细胞的转移和侵袭（图1），该研究为蛇毒精氨酸酯酶（SVAEs）在肝癌控制的分子机制方面提供新见解，并提高了agkihpin用于肝癌治疗的可能性［6］。

图1 肝癌细胞中agkihpin通过降解FZD7抑制经典Wnt/β-catenin信号通路示意图［6］Figure 1 Schematic diagram of agkihpin inhibiting canonical Wnt/βcatenin signaling by degradating FZD7 in liver cancer cell［6］

2.2 通过调节抑（促）癌基因表达或阻滞细胞周期来抑制肿瘤细胞增殖

蛇毒组分抑制肿瘤细胞增殖主要通过两个途径：1）上调抑癌基因表达与下调促癌基因表达。Sv-cystatin基因转染可影响小鼠黑色素瘤B16细胞的蛋白质表达谱。实时定量PCR结果显示，sv-cystatin转染后抑癌基因NM23、RhoGDI-beta、RANBP1的mRNA表达上调，eif5A、eEF1-beta2、MDH1表达下调。Sv-cystatin的作用靶分子主要定位于细胞外周、质膜和细胞核，与转录、半胱氨酸蛋白酶活性、细胞凋亡有关［13］；2）阻滞细胞周期。采用实时定量PCR和Western blot分析NA-LAAO对ECV304细胞周期的影响，发现NA-LAAO可使ECV304细胞阻滞在G1期，并呈量-效关系。cyclin A2、B1、D1、E1、CDK2、CDK6、survivin、skp2表达下调，P21、P16、P27的表达上调［14］。卢康荣等［16］采用流式细胞术检测细胞周期发现11种眼镜蛇毒组分对体外培养的神经胶质瘤细胞U251均有不同程度的生长抑制作用，其中KDⅡ-3使U251细胞阻滞在G0/G1期。

2.3 通过激活线粒体死亡途径诱导肿瘤细胞凋亡

细胞毒素等蛇毒组分可诱导肿瘤细胞凋亡，其主要机制是激活线粒体死亡途径。王艳等［17］研究发现，CTX通过线粒体细胞色素C（cytochrome C，cyt-C）释放到细胞质内，进一步诱导效应性caspase-3激活，活化的caspase-3引起caspase级联反应，完成人肝癌BEL-7404细胞凋亡和清除过程；Song等［19］和赵灿国等［23］研究发现NNAV和蝰蛇毒可分别诱导乳腺癌、卵巢癌细胞凋亡，其机制都可能与下调Bcl-2、上调Bax和caspase-3蛋白表达有关；Aranda-Souza等［18］和郑汝琦等［22］分别研究发现，巴伊亚盾头蝮蛇毒凝集素和AVVC-1使肿瘤细胞线粒体膜电位、cyt-C蛋白表达量明显下降，伴随胞质内cyt-C的荧光强度增强。结果表明，上述两种组分可以促使cyt-C的释放并激活线粒体死亡途径，从而诱导人慢性髓系白血病K562细胞和黑色素B16-F10细胞发生凋亡，并由此发挥其抗肿瘤活性。

2.4 通过调节肿瘤细胞增殖、凋亡和迁移的关键蛋白表达发挥多方面的抗肿瘤作用

Agkihpin、sv-cystatin以及一些粗毒如沙漠眼镜蛇毒和NNAV，具有抑制肿瘤细胞增殖和迁移、促进肿瘤细胞凋亡等多重功能，其机制可能与该蛇毒或蛇毒组分可调节肿瘤细胞增殖、凋亡和迁移的关键蛋白表达有关。

粗毒影响肿瘤细胞分子表达的范围更广。MEV能持续有效地抑制乳腺癌、前列腺癌、多发性骨髓瘤等细胞的增殖和迁移、促进细胞凋亡，其机制包括下调转移趋化因子表达、抑制IGF-1、EGF的表达、增加caspase-3、caspase-8、caspase-9的活性，减少AKT、ERK、IκBα磷酸化，减少cyclin D1表达、增加cyclin B1表达，改变细胞膜电位，上调Bak、Bax、Bim蛋白表达等多个方面［27］。NNAV在体外可明显抑制K562/ADM细胞和原发难治性急性髓细胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）细胞增殖；调节细胞周期停滞于G0/G1期，减少G2/M期的细胞数量，提示NNAV有可能通过干预Bcl-2、caspase-3表达而诱导细胞凋亡。调节细胞周期进程可能是NNAV组分抑制原发难治性AML细胞增殖的作用机制［28］。

2.5 蛇毒抑制癌细胞表达VEGF抑制肿瘤血管生成

肿瘤的生长和转移依赖于病理性内皮细胞侵袭和迁移基础上的血管生成。不同蛇毒组分抑制内皮细胞侵袭和迁移的机制不尽相同，蛇毒去整合素的抑血管生成活性可能与其阻断Akt和ERK1/2信号通路抑制癌细胞表达VEGF有关。Lebein通过诱导活性氧触发蛋白激酶ERK1/2途径激活，明显减少LS174细胞表达VEGF和神经纤毛蛋白1等两种血管生成刺激因子；此外，Lebein通过下调整合素α5β1表达降低LS174细胞黏附和迁移［29］。Jang等［30］研究报道蛇毒去整合素saxatilin抑制NCI-H460细胞的血管生成诱导特性。进一步的实验数据表明，saxatilin通过阻断Akt信号通路下调缺氧诱导因子-1α来抑制NCI-H460细胞分泌VEGF。蛇毒去整合素抑制内皮细胞侵袭和迁移的分子基础对开发新的抗血管生成药物并应用于癌症治疗具有重要意义。

3 结语

综上所述，近年来国内外明确的证据表明多种蛇毒或蛇毒蛋白（肽）对多种恶性肿瘤细胞具有明显的抑制增殖和迁移、诱导细胞凋亡等作用，且呈量-效和时-效关系。归纳蛇毒的抗肿瘤作用机制如下：1）通过抑制某些信号通路来抑制肿瘤侵袭和转移（如精氨酸酯酶、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、凝集素）；2）通过激活死亡途径诱导肿瘤细胞凋亡（如半胱氨酸蛋白酶抑制剂、细胞毒素、L-氨基酸氧化酶等）；3）通过调节抑（促）癌基因表达或阻滞细胞周期来抑制肿瘤细胞生长和增殖（如半胱氨酸蛋白酶抑制剂、氨基酸氧化酶）；4）通过调节肿瘤细胞增殖、凋亡和迁移的关键蛋白表达发挥多方面的抗肿瘤作用（如精氨酸酯酶、半胱氨酸蛋白酶抑制剂等）；5）通过抑制癌细胞表达VEGF而抑制肿瘤血管生成（如去整合素、金属蛋白酶）。

国内外学者对蛇毒抗肿瘤的研究已经取得了较多的成果，对蛇毒抗肿瘤作用机制研究仍是目前的热点，由于蛇毒成分复杂、生化性状各异，不同蛇种、亚种、甚至同一蛇种不同季节所分泌的毒液，其毒性成分均存在一定的差异，故对蛇毒内单一组分的结构和理化性质、蛇毒抗肿瘤的安全有效剂量和不良反应需要深入研究。此外，蛇毒抗肿瘤研究和应用还面临单一组分在蛇毒中含量少、分离技术难度大、成本高，临床用量和实验室用量大，自然蛇毒随环境恶化日渐短缺等问题，希望将来能够通过分子克隆技术生产大量活性强、纯度高的重组蛇毒蛋白。目前，蛇毒的抗肿瘤作用在临床中还仅处于试用阶段，大部分还停留在实验室研究阶段。希望蛇毒抗肿瘤研究和应用能早日应用于临床，更好地造福肿瘤患者。

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Advances in the research on application and antitumor mechanism of snake venom

Miao HUANG1,Qiping HU2

1Radiology Department,Affiliated Tumor Hospital Guangxi Medical University,Nanning 530021,China,2Department of Cell Biology and Genetics,School of Pre-clinical Medicine,Guangxi Medical University,Nanning 530021,China

Qiping HU;E-mail:huqiping@gxmu.edu.cn

Recent literatures on antitumor effect,mechanism,and application of snake venom were summarized.This study aimed to provide a basis for the research,development,and application of snake venom which includes antitumor components.The abilities of snake venom was found in inhibiting tumor proliferation and migration and/or inducing apoptosis in a variety of malignant tumor cells at dose-dependent and/or time-dependent manner.Some types of snake venom inhibit tumoral angiogenesis.Meanwhile,the antitumor mechanisms of snake venom were as follows:1)inhibit tumor metastasis by blocking certain signaling pathways,2)induce apoptosis of tumor cells by activating the death pathway,3)inhibit growth and proliferation of tumor cells by regulating the expression of tumor suppressor(promoter)genes or arresting the cell cycle,and 4)inhibit tumoral angiogenesis by inhibiting the expression of VEGF from cancer cells.Thus,snake venom has potential as an antitumor agent.

snake venom,antitumor,mechanism,proliferation,migration,apoptosis,angiogenesis

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.19.143

①广西医科大学附属肿瘤医院影像学诊断中心（南宁市530021）；②广西医科大学基础医学院细胞生物学与遗传学教研室

*本文课题受广西卫生厅项目（编号：Z2015602）和广西自然科学基金项目（编号：2014GXNSFAA118172）资助

胡启平 huqiping@gxmu.edu.cn

This work was supported by Research Project of the Guangxi Health and Family Planning Commission(No.Z2015602)and Natural Science Foundation of Guangxi Province(No.2014GXNSFAA118172)

（2017-02-13收稿）

（2017-08-30修回）

（编辑：武斌 校对：郑莉）

黄秒 专业方向为肿瘤影像学诊断和蛇毒蛋白抗癌效应的基础研究。

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