七叶一枝花-壳聚糖混合物作为义齿稳固剂的生物安全性及生物相容性研究

张雅琳 孟贺 李金源 吴文慧 梁锐英

七叶一枝花-壳聚糖混合物作为义齿稳固剂的生物安全性及生物相容性研究

张雅琳 孟贺 李金源 吴文慧 梁锐英

目的评价七叶一枝花-壳聚糖混合物的生物安全性及生物相容性。方法参照国家标准GB/T 16886.12-2005、YY/T 0279-1995及GBT16886.5-2003规定的方法，将七叶一枝花-壳聚糖混合物按0.1 g/ml的标准放入浸提介质中，37 ℃条件下、浸提24 h制备浸提液，采用口腔黏膜刺激试验、细胞毒性试验以及流式细胞术初步评价七叶一枝花-壳聚糖混合物的生物安全性及生物相容性。结果金黄地鼠口腔黏膜与试样接触部位未见出血、肿胀，组织学观察未出现病理性改变，七叶一枝花-壳聚糖混合物无口腔黏膜刺激性；对L929细胞无细胞毒性；对L929细胞的周期及凋亡无显著影响。结论初步认为七叶一枝花-壳聚糖混合物具有良好的生物安全性和生物相容性。

七叶一枝花； 壳聚糖； 生物安全性； 生物相容性； 义齿稳固剂

无牙颌患者牙槽骨的不断吸收，使牙槽骨变窄、变矮，软组织萎缩、松软，导致全口义齿固位不良[1]。另外，由于全口义齿戴入口内后，义齿基托与黏膜之间环境改变，更利于微生物的黏附与繁殖[2]，可导致义齿性口炎。义齿稳固剂又称义齿黏附剂，是具有粘接性能的制剂，作用于义齿基托组织面，使义齿与黏膜紧密黏附，达到提高义齿固位和稳定的作用[3]，理想的黏附时间为12～16 h。进口的义齿稳固剂能够在一定程度上增强义齿固位，提高咀嚼效率，但不能预防或治疗义齿性口炎。中药七叶一枝花具有抗菌、抗病毒、消炎等作用，近年来研究发现，七叶一枝花对口腔临床常见病原菌的生长均有抑制作用，对口腔细菌性疾病的临床治疗具有潜在的药用价值。壳聚糖是甲壳质的初级衍生物，具有较高的生物黏性和黏膜吸附性，并且有良好的生物相容性和很好的机械性能[4-5]，已广泛应用于医学、食品等各领域。本实验利用七叶一枝花与壳聚糖制备的混合物作为义齿稳固剂，采用口腔黏膜刺激试验、细胞毒性实验和流式细胞术评价其生物安全性及生物相容性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株与药品 L929细胞株(华北理工大学实验室提供)；水溶性壳聚糖(河南华康生物科技有限公司)；七叶一枝花(北京同仁堂医药公司)。

1.1.2 实验动物 60～70 d健康雄性金黄地鼠10 只，口腔双侧颊囊黏膜无病变。

1.1.3 主要试剂与仪器 RPMI 1640培养基、胎牛血清(Gibco，美国)；二甲基亚砜(Amresco，美国)；细胞培养箱(Hera Cell 150，Heraeus，德国)；高速离心机(Sorvall Super T 21，Dupont，美国)；倒置相差显微镜(Olympus，日本)；酶联免疫检测仪(BIO-RAD，美国)；流式细胞仪(BD公司，美国)。

1.2 方法

1.2.1 口腔黏膜刺激试验 七叶一枝花-壳聚糖混合物的制备：将经水煎法提纯的七叶一枝花粉剂0.05 g溶于32 ml纯水中搅拌溶解，加入水溶性壳聚糖0.64 g，搅拌混匀后得到浅棕色半透明混合物，每次实验均配制新溶剂。根据本课题组前期实验通过粘接抗张强度的测定以及抑菌圈实验得知，此配制比例中，壳聚糖为最高黏度中的最低用量，七叶一枝花为抑制白色念珠菌的最小浓度[6]。将40 g新制备的七叶一枝花-壳聚糖混合物浸泡于200 ml生理盐水，37 ℃条件下浸提5 d，提取上清液100 ml作为材料浸提液。

将动物随机分为2 组，腹腔注射10%水合氯醛麻醉后将直径约5 mm的浸有七叶一枝花-壳聚糖混合物浸提液的棉球置于第1组动物的左侧颊黏膜极低处作为实验组；浸有pH为2的醋酸的棉球置于第2组动物的左侧颊黏膜极低处作为阳性对照；2 组动物的右侧均放置生理盐水棉球作为阴性对照[7]。分别于1、4、6、8h进行肉眼观察后取与试样接触部位颊黏膜及周围组织，常规固定、HE染色后组织切片观察。

1.2.2 体外细胞毒性实验 浸提液的制备及分组：将七叶一枝花-壳聚糖混合物按0.1 g/ml的标准[8]放入含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，37 ℃条件下浸提24 h。将浸提液稀释为100%、75%、50%、25%浓度的实验组，另设阴性对照组(正常完全培养基)，Protefix义齿稳固剂组(用完全培养基按0.1 g/ml标准浸提)，阳性对照组(含0.1%苯酚的完全培养基)。将L929细胞配制成最佳密度的细胞悬液(6×104/ml)接种于96 孔板，每孔200 μl，每组接种6 个复孔。24 h后弃去原培养液，各组加入相应浓度的浸提液，分别于24、48、72、96 h时各取出一块培养板，每孔加入5 g/L的MTT溶液20 μl，继续培养4 h后，吸去孔内培养液，每孔加入150 μl DMSO，放入酶联免疫检测仪于490 nm波长下测吸光度值(A值)[9]。计算细胞相对增值率(RGR)，RGR=(各浓度组A均值/阴性对照组A均值)×100%，根据5 级毒性评价标准[10]对各组结果进行分级(表 1)。

表 1 细胞毒性分级

1.2.3 流式细胞仪检测细胞周期及凋亡 将3 组生长状况良好的L929细胞置换无血清培养基进行细胞同步化，继续孵育24 h后随机分为七叶一枝花-壳聚糖组、阴性对照组和阳性对照组，弃去原培养基，分别置换等体积相应培养基继续培养48 h。

1.2.3.1 细胞周期检测 收集3 组细胞，PBS冲洗3 次，70%冰乙醇固定。核糖核酸酶消化，碘化丙啶(propidium iodide，PI) 室温染色30 min，流式细胞仪检测细胞周期分布。

1.2.3.2 细胞凋亡检测 收集3 组细胞，PBS冲洗3 次，计数1×106个细胞加入 2 ml刻度EP管中，4 ℃、2 000 r/min离心5 min，加入500μl结合缓冲液重悬细胞，避光下加入2 μl AnnexinV-FITC 混匀，加入5 μl PI混匀，室温避光15 min后上机检查。

1.3 统计学分析

2 结 果

2.1 口腔黏膜刺激试验

肉眼观察：分别于1、4、6、8 h时观察，棉球在位情况良好无脱落，所有实验动物无全身不良反应，与七叶一枝花-壳聚糖混合物接触的颊黏膜无红肿、糜烂及溃疡等现象，而与醋酸接触的黏膜有颜色异常、充血、红肿等反应。

组织学观察：与阳性对照材料接触的黏膜上皮可见水肿增厚、糜烂及慢性炎细胞浸润等病理改变;固有层可见水肿,血管扩张、充血及灶性慢性炎细胞浸润(图 1A)。与试验材料七叶一枝花-壳聚糖混合物接触的全部动物黏膜上皮完整,无血管扩张及炎细胞浸润(图 1B)。

A： 阳性对照组； B： 浸提液组

表 2 细胞毒性测定结果(n=6)

Tab 2 Results of cytotoxicity assay(n=6)

2.2 体外细胞毒性实验

各组不同时间点的平均A值，RGR 值及毒性分级结果见表 2。

2.3 各实验组对细胞周期及凋亡的影响

各组细胞凋亡率和细胞周期分布情况见表 3，图 2～3。七叶一枝花-壳聚糖混合物浸提液组对细胞周期无特殊影响(P>0.05)，与阴性组间凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)。

Tab 3 Apoptosis and cell cycle of L929 cells(%，n=3，±s)

A： 阴性组； B： 浸提液组

A： 阴性组； B： 浸提液组

3 讨 论

全口义齿固位不良不仅影响患者的咀嚼效率及美观，还会影响义齿的稳定，进而引起黏膜溃疡或大范围黏膜损伤。另外，全口义齿在口内佩戴一段时间后表面易聚集菌斑而导致义齿性口炎，而白色念珠菌感染是义齿性口炎的重要致病因素[11-12]。因此，我们在前期实验的基础上将七叶一枝花-壳聚糖混合物作为义齿稳固剂，进一步对其进行初期的生物安全性和生物相容性评价，为将来其作为义齿稳固剂应用于临床提供一定的实验依据。

口腔黏膜刺激试验主要用于评价牙科材料对口腔黏膜产生的刺激作用，最接近材料的使用环境,而金黄地鼠的颊囊结构特殊，是黏膜刺激试验的良好实验环境[13]。从实验结果来看,七叶一枝花—壳聚糖混合物对口腔黏膜的刺激反应与阴性对照组无显著差异，表明该材料对口腔黏膜无不良刺激,在黏膜刺激试验中表现出良好的生物安全性。

MTT比色法是一种检测体外培养细胞生长存活的方法，其染色原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。结晶甲瓒经二甲基亚砜溶解后于酶标仪比色，可根据测得的A值判断活细胞数量[14]。本研究通过MTT实验检测七叶一枝花-壳聚糖混合物对L929细胞的毒性结果在第1天为0 级，第2天、第3天及第4天为1级，均属于安全范围，并且义齿稳固剂在口腔内存留时间不会超过义齿佩戴时间，一般为8～12 h，24 h之内七叶一枝花-壳聚糖混合物的细胞毒性为0 级，证实七叶一枝花-壳聚糖混合物作为义齿稳固剂是一种安全的口腔材料。

流式细胞仪的实验结果显示，七叶一枝花-壳聚糖混合物浸提液与正常培养基培养的细胞S期、 G2期细胞比例及细胞凋亡率差异无显著性，反映了七叶一枝花-壳聚糖混合物与正常培养基相比对细胞行为功能无显著影响，具有良好的生物相容性。

本实验通过黏膜刺激试验、细胞毒性试验和流式细胞术分别在动物水平和细胞水平初步证实七叶一枝花-壳聚糖混合物具有良好的生物安全性和生物相容性。然而，本实验仍为初期筛选实验，对临床应用材料的生物安全性和生物相容性的全面评价仍需结合一系列生物安全性测试(如皮肤致敏试验、长期毒性试验及溶血试验等)才能完成。

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ThebiologicalsafetyandbiocompatibilityevaluationofthemixtureofParispolyphylla-chitosanfordentureadhesive

ZHANGYalin,MENGHe,LIJinyuan,WUWenhui,LIANGRuiying.

063000Tangshan,DepartmentofProsthodontics,SchoolofStomatology,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,China

Objective: To study the biological safety and biocompatibility of the mixture of Paris polyphylla-chitosan.MethodsAccording to the GB/T 16886.12-2005 standard, YY/T 0279-1995 standard and GBT16886.5-2003 standard, samples were prepared and tested by oral mucous membrane irritation test, cytotoxicity test and flow cytometry.ResultsNo local response to the mixture of Paris polyphylla-chitosan was found, and the visual observation and pathological findings of oral mucosa were normal and similar to that of the control group. Therefore, the mixture of Paris polyphylla-chitosan had no irritation response to oral mucosa.The mixture of Paris polyphylla-chitosan showed no cytotoxicity to L929 cells,and did not affect the cycle distribution and apoptosis of L929 cells.ConclusionThe mixture of Paris polyphylla-chitosan has good bio-safety and biocompatibility.

Parispolyphylla;Chitosan;Biologicalsafety；Biocompatibility；Dentureadhesivecream

063000 唐山, 华北理工大学口腔医学院修复教研室

孟贺 E-mail： menghe10.2@163.com

R783.6

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.05.010

(收稿： 2017-03-01 修回： 2017-06-15)