瓜蒌皮抗肿瘤活性成分的初步研究

程 倩，嵇乐乐，韩雪娇，仲启迪，辛 江，贾建波

(淮阴工学院 生命科学与食品工程学院，江苏 淮安 223003)

瓜蒌皮抗肿瘤活性成分的初步研究

程 倩，嵇乐乐，韩雪娇，仲启迪，辛 江，贾建波*

(淮阴工学院 生命科学与食品工程学院，江苏 淮安 223003)

采用改进的MTS法来探究瓜蒌皮石油醚相不同极性成分对结肠癌HCT-116细胞和乳腺癌MCF-7细胞增殖的抑制作用，探讨其抗肿瘤活性。利用硅胶柱色谱制备极性不同的五种成分，改进的MTS法检测细胞的增殖作用，Propidium Iodide染色法分析HCT-116细胞周期；Annexin V-FITC/Propidium Iodide染色法分析HCT-116细胞凋亡。在低浓度情况下发现，瓜蒌皮醚相极性成分促进MCF-7细胞生长，成分E诱导细胞停滞在S-期而起到抑制癌细胞增殖的作用，并且成分C及E抗癌细胞增殖作用是通过诱导细胞凋亡介导的作用机制，并以剂量依赖方式诱导其细胞凋亡。通过硅胶柱色谱制备的石油醚相不同极性成分具有抗肿瘤活性。

瓜蒌皮；硅胶柱色谱；细胞系；抗肿瘤

0 引言

癌症目前已经成为威胁人类健康的重大疑难疾病之一。由于缺乏有效的治疗手段，因癌症死亡的人数呈现逐年递增的趋势[1]。而中药作为天然产物存在着广泛的生物活性物质，因此近年来国内外抗肿瘤药物的研究已逐渐转向天然动植物，中医药治疗肿瘤逐渐成为肿瘤治疗领域的一个新途径[2]。相比于西药，中药治疗肿瘤具有多个作用靶点、多种治疗效应、疗效作用持久及不易复发等诸多优势[3]。其中栝楼属植物抗肿瘤活性研究近几年越来越受到国内外研究者的重视。瓜蒌皮的体外抗癌效果较瓜蒌仁强，子壳和脂肪油均无效，自瓜蒌皮醚浸出液中得到的类白色非晶体性粉末也有体外抗癌作用[4-5]。

瓜蒌皮为葫芦科植物栝楼或双边栝楼的干燥成熟果皮[6]，属于常用中药，始载于《神农本草经》[7]，具有清热涤痰、宽胸散结、润燥滑肠等功效，用于治疗痰浊黄稠、肺热咳嗽、结胸痞满、胸痹心痛、乳痈、常痈肿痛、肺痈、大便秘结等症状[8]。现代药理研究表明，瓜蒌皮的药理作用主要包括对心脏、血管的保护作用[9]，抗血小板聚集的作用，降低血清胆固醇、血糖的作用[10]，促进免疫的作用，抗菌抗炎作用，抗肿瘤[11]的作用等。

为指导正确使用瓜蒌皮对肿瘤的治疗，对瓜蒌皮的抗肿瘤作用做了初步研究。前期研究表明瓜蒌皮石油醚相具有抗肿瘤作用，本研究采用体外细胞培养法评价抗癌活性，选用人结肠癌细胞系HCT-116和人乳腺癌细胞系MCF-7为评价模型，通过MTS法[12]测定细胞活力、探索瓜蒌皮的抗癌活性，及瓜蒌皮活性成分与抗癌之间的关系。

1 实验材料及仪器

1.1实验原料与试剂

瓜蒌皮，购于江苏淮安盱眙当地，50～55℃下烘干至质量恒定后粉碎过筛备用；结肠癌细胞系HCT-116，乳腺癌细胞系MCF-7，来源于ATCC细胞库；McCoy’s 5A培养基，DMEM培养基，购于上海中乔新舟生物科技公司；致死牛血清蛋白FBS，购于上海复蒙基因生物科技有限公司；200 ×青霉素-链霉素溶液，购于上海千曦生物科技有限公司；细胞增殖分析试剂盒，细胞凋亡检测试剂盒，Propidium Iodide (PI)，RNase，购于上海吉满生物科技有限公司；甲醇等试剂均为分析纯。

1.2实验仪器与设备

DJ-10A倾倒式破碎机，上海淀久中药机械制造有限公司；B-220旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；JY88-Ⅱ超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司；WH-3微型漩涡混合仪，上海沪西分析仪器厂有限公司；PHS-3C精密酸度计，上海精密科学仪器公司；200～300目硅胶，青岛海洋化工有限公司；FACScan流式细胞仪，上海曙诚医疗科技发展有限公司。

2 实验方案

2.1瓜蒌皮石油醚相不同极性成分制备

准确称取药材0.5 kg，粉碎，过60目筛，用10倍体积的80%乙醇超声破碎提取三次，将提取液于40℃旋转蒸发浓缩，得瓜蒌皮浸膏103.47 g，溶于5倍体积的去离子水中，用等体积的石油醚萃取三次，收集石油醚相，减压浓缩得到石油醚相浸膏18.29 g。用少量石油醚溶解后上硅胶柱色谱，依次用石油醚、石油醚-乙酸乙酯=10:1，石油醚-乙酸乙酯=5:1，石油醚-乙酸乙酯=1:1，乙酸乙酯进行洗脱，得五种不同极性成分A、B、C、D、E。

2.2癌细胞的培养

结肠癌细胞系HCT-116和乳腺癌细胞系MCF-7 分别用McCoy’s 5A和DMEM培养基培养，其中均补加有10% FBS和50 units/mL的青霉素-链霉素混合液，细胞培育均在由5% CO2和95%空气组成的潮湿空气中，温度控制在37℃。

2.3用改进的MTS法进行细胞增殖分析

细胞培养在96孔培养板中，24 h后，用含有不同浓度DMSO培养液更换培养板中培养液，DMSO最终含量为0.5%。用0.5% DMSO作为空白对照，所有实验均进行3次，参照厂家说明书，用MTS试剂盒评价细胞增殖，暴露处理结束后，在每一培养孔中用含有20 μL MTS 试剂的100 μL新鲜培养基替换，并放回培养箱中培养1～2 h，从每孔中取60 μL转移至96孔ELSA板，于490 nm波长下记录其吸光度。结果用相对空白对照的百分比计 (仅含0.5% DMSO的空白对照记为100%)。

2.4 Propidium Iodide染色法分析HCT-116细胞周期

为进一步评价瓜蒌皮不同极性成分A→E对抗癌潜力的影响，用不同浓度的成分A和E处理HCT-116细胞系。细胞接种在24孔细胞培养板中，48 h后更换培养基，培养基中分别含有不同浓度的成分A和E，再培养48 h后收获细胞，用80%乙醇在蜗旋下温和固定，置于冰柜中2 h，于冰浴上用0.25% Triton X-100 处理5 min，细胞悬浮于含有40 μg/mL PI和0.1 mg/mL RNase的300 μL PBS中，室温下暗室培养20 min，用FACScan流式细胞仪分析测试细胞周期，并用FlowJo 10.0.4软件 (Tree Star, Ashland, OR)进行数据分析，对每一次测量，至少计数20000个细胞。

2.5 Annexin V-FITC/Propidium Iodide染色法分析HCT-116细胞凋亡

细胞接种于24孔细胞培养板中，培养1天后更换培养基，培养基中含有不同浓度的A、C、E，培养48 h后收集悬浮细胞及粘壁细胞(用0.25%胰酶脱附后)，加入含有FBS培养基使胰酶失活，轻轻吹散后，在1500 r/min下离心5 min，吸除上清液，根据厂家说明用Annexin V-FITC 和PI试剂盒染色处理细胞。用未加药处理的细胞双染后作为空白对照。染色后，立即用FACScan流式细胞分析，每次测量中，至少计数20000个细胞。

3 结果

3.1五种不同极性成分对HCT-116及MCF-7的抗增殖作用

分析瓜蒌皮石油醚相五种不同极性成分对癌细胞生长抑制的影响，结果如图1所示。

20 μg/mL浓度处理48 h，成分A抑制了8.1%的HCT-116细胞生长，而成分E抑制了83.8%的细胞生长，其它成分抗增殖潜力介于A和E之间。 瓜蒌皮石油醚相不同极性成分对MCF-7细胞的敏感性比HCT-116低。在100 μg/mL浓度下，成分A抑制了20.5% MCF-7细胞生长，而成分B、C、D、E分别抑制30.1%、55.4%、65.5%、87.6%。在低浓度情况下发现，瓜蒌皮醚相极性成分反而促进MCF-7细胞生长。而成分E对HCT-116及MCF-7细胞的IC50浓度分别为5 μg/mL与30 μg/mL。

图1 不同极性成分对HCT-116及MCF-7癌细胞的浓度依赖的抗增殖作用

此外，还发现培养时间也影响醚相不同极性成分的抗癌细胞增殖效力。取10 μg/mL的五种极性成分分别处理HCT-116和MCF-7细胞24、48、72 h，结果如图2所示，发现成分E对HCT-116细胞生长分别抑制了57%、61%、80%，对MCF-7细胞也有类似抑制效果并且以时间依赖方式抑制癌细胞增殖。此外，成分E对两株癌细胞均呈现出最强抑制作用，这些结果显示瓜蒌皮石油醚相经乙酸乙酯洗脱的成分E能够显著地增强其抗癌潜能。

图2 不同极性成分对HCT-116及MCF-7癌细胞的时间依赖的抗增殖作用

3.2成分A和E对HCT-116细胞周期的影响

为了探讨瓜蒌皮醚相经硅胶柱不同极性溶剂洗脱的成分抑制HCT-116细胞生长的潜在作用机制，运用流式细胞仪分析了细胞周期的轮廓，如图3所示(三行图依次为对照、A、E)。从图中可以发现，相比较于对照，成分A未明显改变细胞周期分布轮廓，而观察到成分 E显著改变细胞周期分布轮廓。在成分E浓度为1 μg/mL与2.5 μg/mL处理下不能改变细胞周期分布轮廓，但随着浓度增大，细胞周期分布轮廓明显被改变了。相较于对照(57.1% 细胞处于G-期、25.3%细胞处于S-期、19.9% 细胞处于G2/M-期)，10 μg/mL成分E处理48 h后G1-、S-、G2/M-期细胞百分比分别为33.1%、46.0%、15.6%；20 μg/mL成分E处理48 h后G1-、S-、G2/M-期细胞百分比分别为25.4%、52.1%、21.7%。结果显示：成分E显著诱导细胞停滞在S-期而起到抑制癌细胞增殖的作用。

图3 不同浓度A及E对 HCT-116细胞周期的影响

图4 不同浓度A、C、E对 HCT-116细胞凋亡作用的影响

3.3成分A、C及E对HCT-116细胞凋亡作用的影响

细胞增殖分析结果显示不同极性成分抑制癌细胞增殖能力与处理细胞时间长短相关联。为进一步探究不同极性成分的作用机制，进行了细胞凋亡分析实验，结果如图4所示(三行图依次为A、C、E)。相较于对照 (早期凋亡细胞为4.7%～5.6%，晚期凋亡细胞为2.2%～3.6%)，用浓度5 μg/mL及10 μg/mL处理48 h后，成分A未增加早期和晚期凋亡细胞数，而成分C温和地增加了早期凋亡细胞至17.6%，成分E快速增加了早期细胞凋亡至48.1%。同样地，也观测到成分C及E显著增加了晚期凋亡。 结果表明成分C及E抗癌细胞增殖作用是通过诱导细胞凋亡介导的作用机制，并以剂量依赖方式诱导其细胞凋亡。进而，也显示了凋亡诱导潜力与成分极性相关联。

4 结论

本文较为系统地研究了通过硅胶柱色谱制备的瓜蒌皮石油醚相五种不同极性成分对结肠癌HCT-116和乳腺癌MCF-7细胞系的抗癌活性，得出以下结论：

在细胞抗增殖作用实验中，五种成分对HCT-116 及MCF-7细胞有着明显的抗增殖作用且以时间依赖方式抑制癌细胞增殖，其中成分E对HCT-116及MCF-7细胞的IC50浓度分别为5 μg/mL与30 μg/mL，并且发现低浓度的成分A反而促进MCF-7细胞生长；利用Propidium Iodide 染色法分析HCT-116细胞周期实验中，其中成分E能够显著的诱导癌细胞停滞在S-期从而起到抑制癌细胞增殖的作用；而Annexin V-FITC/Propidium Iodide染色法分析HCT-116细胞凋亡实验中，成分C及E的抗癌细胞增殖作用是通过诱导细胞凋亡介导的作用机制，并以剂量依赖方式诱导其细胞凋亡。进而，也显示了凋亡诱导潜力与成分对细胞处理时间长短相关联，但其机制还有待进一步深入研究。

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APreliminaryStudyontheAntitumorConstituentsofPericarpiumTrichosanthis

CHENG Qian, JI Le-le, HAN Xue-jiao, ZHONG Qi-di, XIN Jiang, JIA Jian-bo*

(Faculty of Life Science and Food Engineering, Huaiyin Institute of Techonology, Huai'an Jiangsu 223003, China)

Improved MTS method was used to explore the inhibitory effect of different polar components in human colon cancer HCT-116 cells and breast cancer MCF-7 cell proliferation gualoupi petroleum ether, and its antitumor activity was explored. Using silica gel column chromatography to prepare five different components with different polarity, the proliferation of MTS cells was detected. The improved method Propidium Iodide staining was used for the analysis of HCT-116 cell cycle. Analysis of apoptosis of HCT-116 cells was by Annexin V-FITC/Propidium Iodide staining. In the case of low concentration, gualoupi ether polar components promote the growth of MCF-7 cells. E components induce the cell cycle in S- phase to inhibit the proliferation of cancer cells; E cancer cell proliferation is through the mechanism of inducing apoptosis mediated, and inducing apoptosis in a dose dependent manner. The petroleum ether phase with different polar components prepared by silica gel column chromatography has antitumor activity.

Trichosanthes; silica gel column chromatography; cell line; antitumor

TQ461

A

1009-7961(2017)05-0036-05

2017-06-19

江苏省研究生创新计划基金项目(HGYK201603)

程倩(1989-)，女，江苏宿迁人，在读硕士，主要从事生物化工研究。*为通讯作者。

(责任编辑：郑 菲)