犬瘟热病例消化系统的病理形态学研究

刘志科,潘耀谦,张秋雨,杨宁宁,陈创夫

犬瘟热病例消化系统的病理形态学研究

刘志科1,潘耀谦2,张秋雨2,杨宁宁1,陈创夫1

（1.石河子大学动物科技学院,新疆石河子832003；2.河南科技学院动物科学学院,河南新乡,453003）

为了解犬瘟热病例消化系统的病理变化发生过程和机制,对3例自然感染犬瘟热的藏獒病例进行了临床观察和病理学研究.采取病犬胃、肠、肝脏、胰腺等组织器官,按照石蜡组织切片制作技术进行切片.经H.E染色、PAS糖原染色以及免疫ABC染色后观察,可以清晰地观察到细胞核与细胞质的形态变化以及细胞浆出现的包涵体.结果显示：这些病例的消化系统出现了严重病变.肝脏水肿,中央静脉和窦状隙扩张,淋巴管扩大且管腔内含大量丝状蛋白,肝细胞严重变性,在细胞浆内或核内有包涵体存在；胃肠道黏膜上皮细胞坏死,部分胞浆呈空泡状,黏膜上皮肿胀、脱落,淋巴细胞浸润；胰腺萎缩,H.E染色可见胰岛细胞变性,细胞核浓缩.犬瘟热病毒对消化器官的入侵,可发生明显的机能障碍变化,这些病变为探究犬瘟热的发病机制、诊断和预防工作奠定了基础.

犬瘟热；消化系统；临床症状；病理组织学；发病机制

犬瘟热（canine distemper,CD）,俗称犬瘟,是由犬瘟热病毒引起的犬科,特别是3～12月龄的幼犬的一种急性、高度接触性、败血性传染病,该病发病率高,死亡率也极高,是犬病中致死性最高的传染病[1-3].病毒主要侵害呼吸系统、消化系统和神经系统[4].发病早期以双相热,并伴随急性鼻卡他、支气管炎和肺炎,以及非化脓性脑炎脊髓炎为特征；后期可见神经症状出现,如痉挛、抽搐[5-6].部分病例脚底表皮化脓和结痂.经调查发现犬瘟热常与犬细小病毒病、犬传染性肝炎、肺炎、寄生虫性肠炎（如小袋虫、球虫、隐孢子虫）等伴发[7-9].此外有研究表明,犬瘟热病毒与人类的麻疹病毒同样属于副黏病毒科,关系非常密切,在临床诊断和病理组织学上的变化特征也颇为相似.在麻疹康复患者的血清中可以检测到犬瘟热病毒中和抗体,而麻疹患者在麻疹中和抗体增高的同时,犬瘟热抗体效价随之增高[10].并且大量研究发现人的佩吉特氏骨病可由犬瘟热病毒所致.此病不仅严重影响犬类养殖业的经济效益,而且影响公共卫生学.近年来,有不同物种的动物出现犬瘟热病例报道,一些灵长类动物和小熊猫也发生感染,从而引起更多学者的广泛研究和关注[11].本文以自然感染犬瘟热的病犬为试验对象,对患病犬消化系统的临床症状、剖检病变和组织病理学变化进行了系统研究,旨在为进一步探讨犬瘟热的发病机理、判断预后和临床用药等方面提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 试验病料

病料采自自然感染犬瘟热病毒的3只藏獒幼犬,同窝生,3月龄.

1.2 仪器与试剂

光学显微镜、荧光显微镜均购于德国ZEISS公司；组织切片机购于德国Leica公司；生物组织包埋机购于浙江省金华市益迪医疗设备厂；二甲苯、无水乙醇、苏木精、伊红、三氯化铁、丽春红、磷钼酸、光绿、冰醋酸、高碘酸、希夫试剂、亚硫酸氢盐等均购于北京索莱宝科技有限公司.

1.3 试验方法

1.3.1 石蜡切片制作、染色与显微观察 解剖死亡病例,取胃、肠、肝和胰脏等组织,先用体积分数为10%的甲醛溶液进行固定,然后脱水、透明、浸蜡、包埋、切片,再用苏木精-伊红（H.E）染色、PAS糖原染色和免疫组化ABC法染色,最后在显微镜下进行观察.

H.E染色：二甲苯Ⅰ（10 min）→二甲苯Ⅱ（10 min）→100%乙醇（2 min）→90%乙醇（2 min）→80%乙醇（2 min）→70%乙醇（2 min）→苏木精（10 min）→1%盐酸乙醇（30 s）→伊红（30 s）→70%乙醇（2 min）→80%乙醇（2 min）→90%乙醇（2 min）→100%乙醇（2 min）→二甲苯Ⅰ（10 min）→二甲苯Ⅱ（10 min）→树胶封片.

PAS糖原染色：二甲苯Ⅰ（10min）→二甲苯Ⅱ（10min）→100%乙醇Ⅰ（2min）→100%乙醇Ⅱ（2 min）→95%乙醇（2min）→85%乙醇（2min）→75%乙醇（2min）→高碘酸（5min）→蒸馏水洗→Schiff试剂（25min）→自来水洗→亚硫酸氢盐Ⅰ（2 min）→亚硫酸氢盐Ⅱ（2 min）→亚硫酸氢盐Ⅲ（2 min）→自来水（10 min）→蒸馏水洗（2 min）→苏木精（5 min）→蓝化（10 min）→95%乙醇（2 min）→100%乙醇Ⅰ（2 min）→100%乙醇Ⅱ（2 min）→二甲苯Ⅰ（10 min）→二甲苯Ⅱ（10 min）→树胶封片.

免疫ABC染色：二甲苯Ⅰ（10min）→二甲苯Ⅱ（10min）→100%乙醇Ⅰ（2min）→100%乙醇Ⅱ（2min）→95%乙醇（2 min）→85%乙醇（2 min）→75%乙醇（2 min）→30 mL/L甲醇过氧化氢（10 min）→柠檬酸缓冲液,高压灭菌（20 min）→滴加山羊血清→滴加一抗（4℃冰箱孵育）→充分水洗→滴加被标记的二抗（30 min）→充分水洗→DAB显色→苏木精复染→95%乙醇（2 min）→100%乙醇Ⅰ（2 min）→100%乙醇Ⅱ（2 min）→二甲苯Ⅰ（10 min）→二甲苯Ⅱ（10 min）→树胶封片.

1.3.2 大体病变观察 先对死亡病例用肉眼进行大致观察,注意患犬外观变化,尤其是口、肛门等部位的变化.然后再仔细观察剖检时各组织器官的变化,注意消化系统的病变特征,如胃、肠、肝和胰脏的变化.

2 结果与分析

2.1 眼观变化

临床症状：多数病例首先表现出精神委顿,体温升高,咳嗽、厌食和呕吐,呈癫痫样症状,眼、鼻流浆液性分泌物,在1～2 d内转变为脓性分泌物,呼吸加快.病初为干咳,后转为湿咳,呼吸困难,严重时发生腹泻并混有血液.

剖检病变：患犬被毛粗乱,尸体消瘦,剖检后可见黏膜苍白、肌肉色淡、血液稀薄,病变部位主要在消化系统、呼吸系统和神经系统,尤以消化系统的病变最为严重[12].胃肠道黏膜有弥漫性的针尖状的出血点,消化道黏膜呈暗红色,肝脏呈淡红色,轻微肿大、质地脆弱.胰腺肿大,出血.胃肠内容物空虚,点状出血（图1-a）.肠道出血（图1-b）,呈出血性卡他性肠炎（图1-c）,肠系膜淋巴结肿胀,膀胱内壁出血,肠道淋巴结衰竭.

图1 犬瘟热剖检病变症状观察Fig.1 Observation ofpathological changes ofcanine distemper

2.2 病理组织学变化

胃：杯状细胞增多,胃幽门部的杯状细胞增多尤为明显,胃黏膜表面黏液增多,含大量糖原颗粒,PAS反应为阳性；黏膜充血水肿,有的甚至坏死脱落[13].胃腺上皮细胞肿胀坏死,部分胞浆溶解出现空泡.

肠道：黏膜下层淋巴细胞浸润,在胞浆内可见到包涵体[5],肠绒毛内含大量细菌团块,H.E染色时呈蓝色[14].胞质中可见未分化细胞的包涵体,腺腔内存在大量的病原体、脱落的上皮细胞和炎性细胞（图2-a）,部分腺上皮从基质膜脱落,落入管腔,呈管套状,固有膜可见嗜中性白细胞浸润.出血性坏死性纤维素性肠炎,血管破裂,红细胞大量逸出,黏膜局灶性坏死,细胞核崩解,肠淋巴小结疏松,淋巴小结顶端黏膜坏死,形成溃疡,肠上皮细胞大面积变性、坏死、脱落,细胞核消失,毛细血管扩张、充血、出血,部分血管坏死,纤维素凝固在血管周围（图2-b）,肠腺细胞坏死（图2-c和2-d）.

图2 肠道组织的H.E染色Fig.2 H.E stainingofintestinal tissue

肝脏：肝小叶结构紊乱,肝脏弥漫性瘀血,肝窦扩张（图3-a）,窦内有大量红细胞积聚.有的肝细胞轻度萎缩（图3-b）,肿胀、出现脂肪变性和颗粒变性,呈空泡状,细胞核溶解,肝细胞内及各级胆管中有大量胆色素沉着[13].肝脏瘀血严重、变形和坏死,窦状隙有大量的红细胞积聚,形成黄疸[4].

图3 肝脏组织的H.E染色Fig.3 H.E stainingofliver tissue

胰腺：胰岛整体变小,散在分布,胰岛细胞变少（图4-a）,细胞的边界不明显,细胞核浓缩,发生退行性变性.胰岛瘀血（图4-b）,细胞质模糊不完整但细胞核清晰可见,胰岛内血管内皮细胞出现脂肪变性,呈空泡状.动脉管壁外膜增厚,内皮细胞的细胞膜增厚.

图4 胰腺组织的H.E染色Fig.4 H.E stainingofpancreatic tissue

胰腺充血,胰腺内存在大量空泡和囊泡,胰腺细胞内有大量糖原颗粒蓄积,PAS反应呈阳性,见图5.

图5 胰腺组织的PAS染色Fig.5 PASstainingofpancreatic tissue

2.3 免疫ABC法

通过免疫ABC染色,胃腺的分泌上皮细胞、胃肠的基底颗粒细胞、小肠绒毛中的柱状细胞、大肠黏膜上皮中的杯状细胞、散在于上皮细胞之间的内分泌细胞和集合淋巴小节的淋巴细胞反应均呈阳性[15].此外,在断裂的肠绒毛和脱落上皮内的阳性反应也较明显,含大量病毒颗粒,见图6.

图6 免疫ABC染色Fig.6 Immunization with ABCstaining

3 讨论

3.1 感染犬瘟热所引起的腹泻与病犬死亡的关系

犬瘟热病毒属于负链RNA病毒,有囊膜,对上皮细胞和淋巴细胞有很强的亲嗜性,改变细胞的显微结构,出现炎症反应,导致体温升高,引起犬食欲不振,逐渐转为食欲废绝[16].由于消化机能紊乱,胃肠黏膜坏死,上皮脱落,往往导致消化吸收障碍.感染初期常出现便秘,不久便转为腹泻,由于胃肠道内大量杯状细胞增生,分泌大量黏液,并混杂有坏死脱落的消化道上皮细胞、中性白细胞、单核细胞等,此外肠道微血管常常破裂,所以粪便中含大量黏液,有恶臭,有时混有血液和气泡.腹泻严重者可导致机体脱水和酸中毒,长期可导致重度营养不良,酸中毒可使毒素在胃肠道聚集,进而导致体温升高[17].有时在病患交界处,健康处血管扩张充血,而患处肠腺腺腔内坏死脱落的上皮细胞产生大量毒素,毒素可被临近扩张的血管吸收,进而导致自体中毒,严重的还可使患犬昏迷.由于血红蛋白水平下降,血液中的红细胞数量减少,进而引起贫血表现,甚至可出现营养不良性水肿.由于腹泻引起血管破裂,黏膜坏死,引起肠道菌群失调,继而引发细菌感染,犬瘟热病毒侵嗜淋巴细胞,降低机体免疫机能,严重的可引起患犬死亡.

3.2 胰腺病变与血糖含量的关系

可能由于病毒在胰脏内寄生,导致胰腺萎缩,胰岛整体减小,并散在存在,胰岛细胞减少,细胞变性.胰岛中主要有胰岛A细胞和胰岛B细胞,分别分泌胰高血糖素和胰岛素,维持血糖浓度平衡[18].使血糖含量升高的激素不止胰高血糖素,还有甲状腺激素和肾上腺素等,而胰岛素则是唯一的降低血糖浓度的激素[19].当胰岛素与细胞膜上的相应受体结合后,就启动了细胞内部一系列的变化,使细胞膜的葡萄糖通道打开,将细胞外的葡萄糖转运到细胞内,再把葡萄糖变成“糖原”的形式储存起来,从而使血糖降低.当血糖降低时,胰高血糖素动员体内脂肪和蛋白质分解,所以剖检时病犬尸体消瘦,被毛较乱.由于胰岛受损,胰岛素含量降低,使血糖浓度高于肾糖阈,临床上出现糖尿,血液检查时血糖含量较高.此外,由于胰腺发生退行性病变,使胰液的分泌量减少,也可导致消化吸收障碍.

3.3 肠淋巴细胞与黏膜免疫的关系

肠消化道淋巴组织中的淋巴细胞构成机体免疫的第一道防线,可以抵御消化道内的病原体入侵.胃肠道激素与消化道淋巴组织共同组成一个复杂的免疫系统,分泌免疫球蛋白[20].黏膜免疫由广泛分布于机体的胃肠道、呼吸道和泌尿道等淋巴组织构成,其中起主要作用的细胞是M细胞.犬瘟热病毒对淋巴细胞和上皮细胞亲嗜性较强.犬瘟热病毒首先侵袭机体的靶器官是分布于淋巴系统各组织的器官[21],犬瘟热病毒易于在淋巴细胞细胞内增殖,引起淋巴细胞损伤,T细胞对丝裂原反应与B细胞抗体生成机能明显下降.对病犬进行病理组织学检查时,发现其免疫系统严重受损,其中肠上皮固有层淋巴细胞明显萎缩,淋巴小结数量减少、体积缩小,导致免疫抑制,黏膜抵抗力下降,导致肠黏膜坏死,如果引起细菌继发感染,会出现白细胞增多,导致发热、腹泻、脱水,甚至自体中毒.

4 结论

研究通过对自然感染的藏獒病例进行临床和病理学诊断,采取了典型的病变组织脏器制作石蜡切片,进行H.E染色、PAS糖原染色和免疫ABC染色观察,发现细胞核浓缩严重,肠绒毛内含大量的蓝色细菌团块,在网状内皮系统和肾盂上皮细胞内有嗜酸性包涵体形成.研究结果充实了犬瘟热组织病料学研究内容,为犬瘟热病确诊和发病机制研究奠定了一定的科学理论基础.

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Pathomorphological research about the digestive system of canine distemper

LIU Zhike1,PAN Yaoqian2,ZHANG Qiuyu2,YANG Ningning1,CHEN Chuangfu1
（1.College ofAnimal Science and Technology,Shihezi University,Shihezi 832003,China；2.College ofAnimal Science,Henan Institute ofScience and Technology,Xinxiang453003,China）

In order to understand the pathological changes,process and mechanism of digestive system in canine distemper,the clinical observation and pathological study of 3 cases of Tibetan mastiff infected with canine distemper were carried out.The stomach,intestines,liver,pancreas and other tissues of the diseased dog were taken and sliced according to the technique of paraffin section.After H.E staining,PAS staining and ABC staining,the morphological changes of the nucleus and cytoplasm and the inclusion bodies of the cytoplasm were observed.The results showed severe digestive disease in these cases.Liver edema,central vein and sinusoidal dilatation,lymphatic lumen expansion,and contains a large number of filamentous protein,liver cells had serious degeneration,inclusion bodies in the cytoplasm or nucleus；gastrointestinal mucosal epithelial cell necrosis,cytoplasmic vacuoles appeared,epithelial swelling and shedding of lymphocytes.Pancreatic atrophy and H.E staining showed islet degeneration and nuclear condensation.The invasion of canine distemper virus into the digestive organs could lead to obvious dysfunction.These series of lesions have laid the foundation for the study of the pathogenesis,diagnosis and prevention of canine distemper.

canine distemper；digestive system；clinical symptoms；histopathology；pathogenesis

S852.65

A

1008-7516（2017）05-0048-06

10.3969/j.issn.1008-7516.2017.05.009

2017-05-15

西部地区高发人兽共患传染性疾病防治协同创新项目（2013-179）

刘志科（1989―）,男,河南新乡人,硕士研究生.主要从事基础兽医学研究.

陈创夫（1962―）,男,广东揭西人,博士,教授,博士生导师.主要从事人畜共患病研究.

（责任编辑：卢奇）