水稻花器官数目异常突变体afon1的表型分析与基因定位

杨成聪，梁容，秦冉，曾冬冬，金晓丽，石春海



水稻花器官数目异常突变体的表型分析与基因定位

杨成聪，梁容，秦冉，曾冬冬，金晓丽，石春海

（浙江大学农业与生物技术学院农学系，杭州 310058）

研究水稻花器官数目异常突变体（）的分子机理，鉴定出控制水稻花器官数目变化的基因。利用甲基磺酸乙酯（EMS）诱变籼稻品种浙农34获得一个花器官数目异常突变体作为试验材料，命名为。开花期随机取突变体和野生型浙农34的稻穗各5个，利用组织学和扫描电子显微镜等技术研究的花器官表型、细胞学特征和花粉育性。成熟期随机取突变体和野生型浙农34植株各10株，测定株高、分蘖数、穗长、每穗颖花数、每穗实粒数和千粒重等农艺性状。随机取突变体和野生型饱满种子各100粒，测定发芽势和发芽率。以突变体为母本，分别与野生型浙农34和粳稻品种浙农大104杂交构建2个F2群体进行遗传分析和基因定位，筛选候选基因进行DNA测序比对，构建AFON1蛋白质的空间模型并对其结构进行分析，同时对候选基因以及与花器官数目相关的基因进行实时荧光定量PCR分析。与野生型相比，突变体中59.64%小穗的花器官数目发生异常，其中多数小穗仅在内稃一侧产生一个颖壳状的器官，部分小穗表现2—4轮花器官数目同时增加；株高和千粒重显著增加，而结实率显著降低。遗传分析表明，突变体与野生型浙农34杂交的F1植株小穗花器官数目表现正常，F2群体中小穗花器官数目正常植株与花器官数目异常植株的分离比符合3﹕1，表明突变体性状受一对隐性核基因控制，基因位于水稻第1染色体长臂端InDel标记1M5和1M18之间，物理距离为73 kb，该区间内共有6个注释基因。突变体和野生型的测序比对发现，突变体中的基因外显子中第565个碱基T突变成A，导致第189个氨基酸由色氨酸突变为精氨酸。蛋白质序列和空间结构分析表明，AFON1蛋白质序列中含有一个Lipase_3结构域，结构域内的突变导致蛋白质的空间结构发生了明显的变化。实时荧光定量PCR结果显示，在突变体幼穗中的表达量要显著高于野生型，而在根、茎和叶中则无显著差异；穗发育早期和/等调控花器官数目的基因在突变体花器官中的表达量显著增加。为突变基因，该基因通过影响花器官数目相关基因的表达而调控各轮花器官数目。

水稻；花器官数目异常突变体（）；基因定位；表达分析

0 引言

【研究意义】水稻是典型的单子叶植物，也是重要的粮食作物之一，其花器官的发育直接影响稻米的品质和产量，但水稻花发育的分子机制有待于进一步深入研究。利用一些新发现的水稻花器官异常突变体，克隆更多花发育基因不仅有助于进一步阐明水稻花器官发育的分子机制，同时也可为分子育种提供重要的理论依据。【前人研究进展】水稻小穗具有确定性，即含有2个护颖和一朵可育的小花，1个外稃1个内稃、2个浆片、6个雄蕊和1个雌蕊构成水稻小花的四轮花器官[1]。双子叶植物的花器官由外至内包括花萼、花瓣、雄蕊和雌蕊。通过对双子叶模式植物金鱼草和拟南芥的研究，前人提出了花发育的“ABCDE”模型[2-6]，该模型认为A、B、C、D和E这5类基因协同调控双子叶植物花器官的形成和发育，其中任何一类基因发生突变都将引起对应轮次花器官的同源异型转化[7]，进而导致花器官的形态和数目发生变化，该模型的部分内容也适用于单子叶植物花器官的发育。除了典型的5大类功能基因外，还有一些基因也参与了水稻颖花发育的过程，如、、、、/、、、()、和等[8-20]。可以通过高温介导线粒体脂肪酶的通路保护下游花器官特性基因、和的表达，抵御环境温度波动而促进花器官稳态[21]。Sun等[20]对突变体的研究表明，JMJ706蛋白通过组蛋白赖氨酸甲基化的途径进行表观遗传修饰，其功能缺失将影响水稻花器官的形态和数目；Clark等[22]和Bleckrnann等[23]通过拟南芥、和突变体研究明确了（）/（）反馈调节环途 径，认为在顶端分生组织中表达后可以诱导分生组织细胞增殖、产生反馈信号，通过/受体复合体激活信号途径在转录水平上降低的表达，而的表达又可反馈调节的表达，从而形成一个调控花分生组织大小的反馈调节环以维持拟南芥整个花发育过程中分生组织的大小。任何一个发生突变，顶端分生组织以及花序和花分生组织都将变大，而小花和花器官数目增加正是由于花分生组织增大所致[22,24]；该反馈调节环也同样适用于水稻花器官数目的调控，关键基因、和对应于水稻的、和[25]。现已明确是编码一个富含亮氨酸重复序列的受体激酶[12]，而则编码一个含有CLE功能域的小分子分泌蛋白[15]。水稻内轮花器官数目增加往往会导致内外稃不能正常闭合，进而严重影响花粉的育性和种子发芽。【本研究切入点】尽管目前与水稻花器官数目相关的基因研究较多，但导致水稻花器官数目异常的分子机制与调控途径尚不清楚。利用甲基磺酸乙酯（EMS）诱变籼稻品种浙农34，获得一个花器官数目异常突变体（），该突变体中59.64%小穗的花器官数目表现出不同程度的增加，其中大部分小穗仅在内稃一侧产生一个颖壳状器官，且具有外稃的维管束特征；极少数小穗表现2—4轮花器官数目同时增加。【拟解决的关键问题】以花器官数目异常突变体为材料进行详细的形态观察和组织学分析，以明确的表型特征；利用SSR等分子标记对进行精细定位、克隆和序列分析，采用实时荧光定量PCR分析在根、茎、叶和穗各组织中的表达特性以及不同时期花器官数目相关基因在突变体花器官中的表达差异，以进一步明确花器官数目异常突变体的特征和控制花器官数目异常表现的分子机理。

1 材料与方法

1.1 供试材料

用EMS诱变籼稻品种浙农34，获得一个能稳定遗传的花器官数目异常突变体。2014年夏在浙江大学紫金港校区试验田用突变体分别与粳稻品种浙农大104和野生型籼稻品种浙农34杂交获得F1，自交后获得F2种子；2015年夏在相同的环境条件下种植亲本、F2定位群体和遗传分析群体。

在鉴定温度影响花器官数目变异的试验中，取籼稻品种浙农34和突变体各20粒种植于实验室组培室内进行温度处理，2个处理条件为35℃光照12 h/20℃暗处理12 h、25℃光照12 h/20℃暗处理12 h，3次重复。

1.2 表型分析与花粉育性鉴定

开花期随机取大田和组培室内突变体和野生型的稻穗各5个，在体式显微镜下解剖观察突变体和野生型的花器官形态和数目并统计数目。参照Zeng等[26]的方法在显微镜下观察花粉育性。成熟期随机取突变体和野生型植株各10株，测定其株高（plant height，cm）、分蘖数（number of tillering，个）、穗长（panicle length，cm）、每穗颖花数（number of floret per panicle，粒）、每穗实粒数（number of filled grain per panicle，粒）、千粒重（1 000-grain weight，g）。

1.3 发芽势、发芽率测定与石蜡切片观察

随机取突变体和野生型饱满种子各100粒，参照钱春荣等[27]方法测定发芽势和发芽率，3次重复。

孕穗期分别取突变体和野生型幼穗，于4℃FAA固定液中固定24 h，经脱水（乙醇梯度）、透明（二甲苯）、包埋（石蜡）、脱蜡、切片（厚度为10 μm）、染色（1%番红和1%固绿）后，在Nikon ECLIPSETI-SR荧光显微镜下观察。

1.4 扫描电镜观察

取孕穗期花序在4℃2.5%戊二醛溶液中固定24 h；0.1 mol·L-1磷酸缓冲液（pH 7.0）漂洗3次，每次15 min；1%锇酸溶液固定1—2 h后取出，用0.1 mol·L-1磷酸缓冲液（pH 7.0）漂洗3次，每次15 min。经乙醇浓度梯度脱水、醋酸异戊酯处理30 min后干燥、镀膜。处理后的样品在Hitachi TM-1000型扫描电镜下观察。

1.5 基因定位与测序比对

应用分离群体分组分析法（bulked segregation analysis，BSA）寻找与目的基因连锁的分子标记。分别选取F2定位群体中突变体和野生型植株各10株，剪取等量叶片混合构成突变池和野生型池，参照简易CTAB法[28]提取亲本、基因池和F2定位群体DNA，利用位于水稻12条染色体上并在粳稻浙农大104和籼稻浙农34间具有多态性的280对SSR和InDel分子标记，筛选连锁标记，初步确定目的基因的位置。

SSR引物序列参照（http://www.gramene.org/ microsat/），由上海生工生物技术公司合成；InDel分子标记由杭州擎科梓熙生物技术公司合成。PCR反应体系为20μL，包括10×PCR buffer 2.0 μL、50 ng·μL-1DNA模板1 μL、2.5 mmol·L-1dNTPs 0.3 μL、ddH2O 15.7 μL、10 μmol·L-1正反向引物各0.3 μL和5 U·μL-1DNA聚合酶0.4 μL。PCR程序为94℃5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃ 30 s，35个循环；72℃10 min，4℃保存。PCR产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、快速银染后于观灯片上观察并统计结果[29]。

利用Gramene网站（http://www.gramene.org/）获取粳稻品种日本晴和籼稻品种9311的目的区间基因组序列，于NCBI网站（https://blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi）进行序列比对，结合使用DNASTAR和Primer 5.0设计开发新的分子标记进行精细定位。根据水稻基因组注释数据库（http://rice.plantbiology. msu.edu/index.shtml）注释候选基因的功能，并对其测序以获得突变基因、突变位点和突变方式。利用生物信息学分析网站（http://smart.embl-heidelberg.de/）和（https://swissmodel.expasy.org/）分析蛋白质序列和结构。

1.6 基因的表达分析

采用Trizol法分别提取突变体和野生型孕穗期时根、茎、叶和穗的总RNA，参照逆转录试剂盒DRR047A（Takara）的操作说明经逆转录合成第一条cDNA链。随后以逆转录合成的第一条cDNA链为模板，参照SYBRⅡ（Tli RNaseH Plus）（RR820A，Takara）的操作方法用荧光定量引物进行实时荧光定量PCR，3次重复。分析不同时期突变体在不同组织中的表达情况，以及参与调控水稻花器官数目的和/在穗中的表达量，用（上游：5′-GTGGTCGCCCCTCCTGAAAG-3′，下游：5′-GGCTTAGCATTCTTGGGTCCG-3′）作为内参基因进行归一化处理。荧光定量PCR反应在Roche LightCycler96实时荧光定量PCR仪上进行，用2-△△Ct计算方法分析结果。

2 结果

2.1 突变体afon1表型分析与农艺性状测定

突变体部分主要农艺性状发生了显著的变化，如株高和千粒重分别比野生型植株增加6.70%和7.27%，每穗实粒数和结实率则分别降低了19.01%和18.84%，其差异均达到显著或极显著水平（图1-A，表1）。内外稃开裂会严重影响花粉的育性。本研究发现，突变体中内外稃开裂小花的花粉育性显著低于野生型植株，仅有18.75%的花粉表现为可育，内外稃闭合状的小花花粉育性则与野生型无显著差异（图1-B—图1-D）。推测内外稃开裂小花的花粉育性显著降低是导致突变体结实率降低的主要原因。

发芽试验结果表明，突变体种子的发芽势与发芽率均显著降低，分别比野生型下降25.87%和13.43%（图1-E）。

表1 突变体afon1和野生型主要农艺性状

*：在0.05水平上差异显著；**：在0.01水平上差异极显著。图6同

*: significant difference at＜0.05 level by-test; **: significant difference at＜0.01 level by-test. The same as Fig. 6

A：抽穗期野生型与突变体afon1植株形态，Bar=10 cm；B：野生型花粉育性；C：突变体afon1内外稃闭合状花粉育性；D：突变体afon1内外稃开裂状花粉育性；E：野生型与突变体afon1发芽试验，Bar=2 cm

2.2 突变体afon1形态与组织学观察

营养生长阶段的突变体与野生型植株无明显差异。抽穗后与野生型（图2-A）相比，突变体中59.64%小穗的花器官数目表现不同程度的增加，其中多数小穗仅在内稃一侧产生一个颖壳状的器官，其他轮次花器官数目表现正常（图2-H和图2-K—图2-L）。观察野生型小穗横切面发现，小穗的外稃具有5个维管束（图2-K），而在突变体小穗的横切面中，内稃一侧产生的颖壳状器官也有5个维管束，表明新增的颖壳状器官与外稃具有较高的相似性（图2-L）。小部分小穗表现2—4轮花器官数目同时增加，主要表现为2个外稃、2个退化的片状内稃、3个浆片、7—11个雄蕊、2—3个子房、3个柱头（图2-B—图2-G、图2-I和图2-M—图2-P）。退化的片状内稃出现在两外稃嵌合的位置导致稃片不能正常闭合，四轮花器官同时增加的小穗其花器官数目并非成倍增加（图2-I、图2-M—图2-P），而子房数目增加的小花往往与成熟时形成双米粒有关（图2-J）。突变体在35℃和25℃不同温度培养条件下，分别有61.23%和60.89%的小穗花器官数目出现异常，两者差异不显著，说明温度的变化对突变体花器官数目异常的表型影响不大。

A：野生型的小花；B、C：突变体afon1雄蕊数目异常；D：突变体afon1的浆片数目异常；E、F：突变体afon1的子房数目异常；G：突变体afon1的柱头数目异常；H、I：野生型和突变体afon1小穗；J：野生型和突变体afon1成熟小穗；K：野生型小穗横切面；L、M、N、O和P：突变体afon1小穗横切面。白色五角星代表雄蕊；黑色五角星代表子房；白色三角形代表浆片；黑色三角形代表柱头；白色四角星代表外稃维管束。A、B、C、K、L、M、N、O和P中，Bar=200 μm；D、E和F中，Bar=100 μm；G中，Bar=50 μm；H、I和J中，Bar=1 mm；sl：不育外稃；gl：颖壳状器官；le：外稃；pa：内稃；st：雄蕊；lo：浆片；ov：子房；sti：柱头

扫描电镜观察发现花器官在花原基发育的早期就发生了变化，形成内外稃原基时在内稃一侧能观察到颖壳状原基（图3-A），内轮花器官原基分化完全后，可清晰观察到内稃一侧有一个颖壳状器官原基（图3-B）、退化成片状的内稃原基出现在两个外稃嵌合的位置（图3-C）。说明从突变体的花分生组织形成稃片原基开始，各轮花器官原基的数目依次开始发生变化。

A、B和C：突变体afon1小花扫描电镜图。A中，Bar=200 μm；B和C中，Bar=100 μm；gl：颖壳状器官；sl：退化颖壳；le：外稃；pa：内稃；st：雄蕊；fm：花分生组织

2.3 突变体afon1遗传分析、afon1定位与蛋白质结构分析

突变体与籼稻品种浙农34杂交获得的F1植株表型和花器官数目均与野生型相同。在F2群体中，花器官数目正常的植株有466株，花器官数目异常的植株有156株，分离比符合3﹕1（2=1.03＜20.05=3.84），说明该突变体性状受一对隐性核基因控制。选用280对分布于水稻12条染色体上、在籼稻浙农34与粳稻浙农大104之间具有多态性的SSR和InDel分子标记，用BSA分池法筛选多态性分子标记。从突变体和浙农大104杂交构建的F2定位群体中随机取46株进行单株验证，将目的基因初步锁定在第1染色体长臂端InDel分子标记1M2（1/46）和1M11（1/46）之间（图4-A）。随后用DNASTAR和Primer 5.0软件在该区间内开发更多具有多态性的分子标记（表2），用上述F2定位群体中的763个植株将基因定位在InDel分子标记1M5（2/763）和1M18（1/763）之间73 kb的范围内（图4-B），该区间内共有6个注释基因（图4-C）。对6个基因进行测序比对后发现，与野生型相比在突变体中仅发生了单碱基替换。进一步对该基因的cDNA编码框进行扩增和测序比对，发现突变体中的外显子第565个碱基T突变成A，导致第189个氨基酸由色氨酸突变为精氨酸（图4-D）。对这6个注释基因的功能进行预测分析，发现是一个脂肪酶基因，总长1 308 bp，仅含一个外显子；其编码产物脂肪酶主要存在于线粒体上，该脂肪酶在茉莉酸合成的初始过程中发挥其催化作用，而植物激素茉莉酸信号途径在小穗分化、花器官形态和数目的确定性过程中扮演着重要的角色[30]，说明该基因是突变体的候选基因。因此，推测的突变导致了突变表型的出现。

表2 部分基因定位多态性引物

A、B：afon1在水稻第1染色体上的连锁图谱；C：该区间内的候选基因；D：突变体afon1和野生型的cDNA测序比对结果

蛋白质序列比对和结构分析还发现，蛋白质序列中含有一个Lipase_3结构域（图5-A），由于结构域内的突变以致蛋白质的空间结构发生了明显变化（图5-B和图5-C）。

2.4 水稻花器官发育相关基因的表达分析

为明确在水稻花器官发育过程中的时空表达模式，利用实时荧光定量PCR检测在根、茎、叶及不同穗发育时期的表达量。结果发现，在根、茎、叶和穗中都有表达。其中，在穗长度＜4.0 cm（早中期）时的表达量显著高于其他组织（图6-A和图6-B），当穗长＞4.1 cm（后期）后在各组织中的表达量则无显著差异（图6-C），说明主要在花器官发育早期发挥调控作用。由于Suzaki等[12]在研究突变体时发现在水稻整个花分生组织中表达，而/仅在花分生组织顶端的几层细胞中表达[13,15]，2个基因均是作为顶端分生组织反馈调节环途径中的主要基因共同参与调控花器官的数目。猜测在穗发育早期，发生单碱基突变后使和/在花分生组织中的表达量增加，引起花分生组织变大，从而导致突变体的花器官数目增加。因此，利用实时荧光定量PCR分析了不同时期、/和的表达差异（表3）。与野生型植株相比，、/和在穗长度＜1.0 cm（早期）时的表达量均显著增加，分别提高了2.6、1.7和3.9倍（图6-D）；当穗长为1.1—4.0 cm（中期）时，和在花器官中的表达量仍显著增加，而/无显著变化（图6-E）；当穗长＞4.1 cm（后期）时，、/和表达量均无显著变化（图6-F）。

A：AFON1蛋白序列；B、C：AFON1蛋白结构A: Sequence of AFON1; B, C: Structure of AFON1

A、B和C：afon1在不同时期不同组织中的相对表达量；D、E和F：不同时期花器官数目相关基因在穗中的相对表达量

表3 qRT-PCR引物

3 讨论

水稻花器官的发育是一个复杂的生物学过程，参与该过程的基因很多，其中任何一个基因发生功能性突变都有可能导致花器官表现异常[30]。水稻正常小穗的小花数目、各轮花器官数目具有恒定性[11,30]，但本研究报道的突变体有59.64%小花花器官数目失去恒定性而表现不同程度的增加，以内稃一侧多一个颖壳状器官为主，极少数小穗因多子房多小花而出现双米粒表型进而导致该粒粒重显著增加。通过基因定位将定位在水稻第1染色体长臂端InDel标记1M5和1M18之间，物理距离为73 kb。

目前，国内外已报道了很多水稻花器官数目异常突变体，如(-)[12-17]、()[18][11]、[10]和[31]。分别位于水稻第6、11、11、11、6、未知、6、5、1和7染色体上。未被定位的其突变体表型以双子房为主，雄蕊数目变化较大，最少仅有1个而最多可达14个[17]。-和-属于等位突变体，其中突变体-仅雌蕊数目发生变化，而突变体-的70%小花有雌蕊4—5个、雄蕊7—12个，其余小花均有额外的浆片和稃片状的器官[12]。和也是一对等位基因，其中，的3个等位突变体、和的雄蕊数目分别增加2.9、2.2和2.0倍[13]；而表现为一次枝梗数目和花器官数目均增加，具有2—10个心皮、6—10个雄蕊，部分小穗的浆片转化成内外稃状器官[15]。以心皮数目增多为主[14]。内外稃正常，仅雄蕊和雌蕊数目发生变化[16]。()以浆片同源转化成内外稃、雄蕊和柱头外露为主[18]。主要表现出在同一个小穗轴上出现多个小花[11]。以多个苞片为主[31]。的2个突变体小穗所有轮次花器官的形态和数目均发生异常变化，主要缺陷为增加一个额外的颖壳，较为严重的突变体会失去小花的确定性；其中突变体的护颖、浆片和雄蕊表现异常，部分小花护颖数目增加了3—4个而其他花器官数目均表现正常。表型缺陷更为严重，在护颖与外稃之间或内外稃之间异位形成多个颖壳状器官，有浆片0—4个（部分增加的浆片出现在稃片外侧、部分浆片还会同源异型转化为稃片状器官），雄蕊数目有1—12个；心皮数目增减不定，其中部分小穗的心皮可以全部转化成颖壳状器官、极少数小穗的几个心皮甚至会融合而生并伴有11个柱头，个别小穗内部出现两朵小花且各小花第3和4轮花器官数目均表现正常[10]。与上述突变体相比，表型与具有较高的相似性且定位区间相同，与其他突变体不仅定位区间不同，而且表型也具有较大差异，因此笔者猜测可能是的等位突变体。也来源于，但由于测序的候选基因的外显子第565个碱基T突变成A，导致第189个氨基酸由色氨酸突变为精氨酸，因此这两个等位突变体基因的突变位置和植株表型有着明显差异。的和2个等位突变体，一个（发生单碱基突变，由C突变为A导致第309位半胱氨酸变成终止密码子；另一个（由T突变为A而导致第178位缬氨酸变成天冬氨酸[10]。在植株性状的表型上，突变体各轮花器官数目仅表现增加，并未出现花器官缺失或数目减少的表型，部分小穗出现四轮花器官同时增加；成熟期部分突变体出现双米粒的特性，而这些表型在是现今发现的第一个调节水稻花器官稳定性的可塑基因[21]，由于与环境之间的互作，突变体花器官形态和数目表现较高的可塑性，的活性随环境温度的升高而增强，极高温条件下花器官缺陷更为明显，而低温环境下花器官无任何异常；该基因通过高温介导线粒体脂肪酶通路保护下游的花器官特性基因、和的表达，抵御环境温度波动进而促进花器官稳态。而本试验的突变体表型几乎不受环境温度的影响。

本研究通过实时荧光定量PCR分析仅在花器官发育早中期参与水稻花器官发育的调控过程，且通过增加花器官数目相关基因的表达而发挥其调控作用。穗发育早期2个基因的表达量显著增加而后期无显著变化，扫描电镜试验表明花器官原基形成早期就能清晰地观察到数目异常的花器官。由此推测基因可能主要在花器官原基形成早期，通过正调控的形式增加水稻花器官数目相关基因在花分生组织中的表达，以改变花分生组织大小，从而影响花器官的数目；但可能由于在各小穗之间的表达有差异，使花器官呈现不同的表型，甚至部分小穗花器官未出现异常。

蛋白质序列比对和结构分析表明，AFON1蛋白序列中含有一个Lipase_3结构域，结构域内单个氨基酸突变导致AFON1蛋白的空间结构发生了明显的变化。因此推测发生在Lipase_3结构域内的突变使AFON1的空间结构发生改变而引起功能变化，进而导致花器官数目增加。由于蛋白空间结构仅发生了局部变化，推测由此引起的蛋白质功能的微弱改变，仅能使59.64%的小穗花器官数目发生变化，以致部分小穗的花器官数目仍能表现正常。此外笔者猜测还可能是因为具有较弱的可塑性且与环境的互作效应较小，部分小穗能维持花器官数目的恒定性。但具体的分子机理与调控途径还需更深入的研究才能加以证实。

4 结论

通过甲基磺酸乙酯诱变获得一个花器官数目异常突变体，其59.64%小穗的花器官数目表现不同程度的增加，株高和千粒重显著增加，而结实率则显著降低。该突变体性状受一对隐性核基因控制，位于水稻第1染色体长臂端InDel标记1M5和1M18之间，物理距离为73 kb；该区间内的为突变基因，是的等位基因。外显子中第565个碱基发生替换使对应氨基酸发生变化，进而导致AFON1蛋白空间结构发生变化而引起功能变异。基因主要在花器官原基发育过程中通过正调控的形式增加花器官数目相关基因的表达，从而影响花器官的数目。

[1] 李云峰, 杨正林, 凌英华, 王楠, 任德勇, 王增, 何光华. 水稻多小花小穗突变体的鉴定与基因定位. 作物学报, 2011, 37(2): 280-285.

LI Y F, YANG Z L, LING Y H, WANG N, REN D Y, WANG Z, HE G H. Characterization and gene mapping of a spikelet mutant, 2011, 37(2): 280-285. (in Chinese)

[2] BOWMAN J L, SMYTH D R, MEYEROWITZ E M. Genetic interactions among floral homeotic genes of., 1991, 112(1): 1-20.

[3] COEN E S, MEYEROWITZ E M. The war of the whorls: genetic interactions controlling flower development., 1991, 353(6339): 31-37.

[4] DITTA G, PINYOPICH A, ROBLES P, PELAZ S, YANOFSKY M. F. Thegene offunctions in floral organ and meristem identity., 2004, 14(21): 1935-1940.

[5] GÜNTER T, HEINZ S. Plant biology: floral quartets., 2001, 409(6819): 469-471.

[6] WEIGEL D, MEYEROWITZ E M. The ABCs of floral homeotic genes., 1994, 78: 203-209.

[7] 龙珏臣, 庄慧, 陈欢, 汪玲, 沈亚林, 曾晓琴, 崔馨允, 桑贤春, 何光华, 李云峰. 水稻颖壳退化突变体()的表型分析与基因定位. 作物学报, 2016, 42(6): 813-819.

LONG J C, ZHUANG H, CHEN H, WANG L, SHEN Y L, ZENG X Q, CUI X Y, SANG X C, HE G H, LI Y F. Phenotypic analysis and gene mapping of() mutant in rice (L.)., 2016, 42(6): 813-819. (in Chinese)

[8] BAI X F, HUANG Y, MAO D H, WEN M, ZHANG L, XING Y Z. Regulatory role ofin the determination of panicle branching and spikelet formation in rice., 2016, 6: 19022.

[9] NAGASAWA N, MIYOSHI M, SANO Y,SATOH H, HIRANO H, SAKAI H, NAGATO Y.andgenes control floral organ identity in rice., 2003, 130(4): 705-718.

[10] LI H G, XUE D W, GAO Z Y, YAN M X, XU W Y, XING Z, HUANG D N, QIAN Q, XUE Y B. A putative lipase generegulates both empty-glume fate and spikelet development in rice., 2009, 57(4): 593-605.

[11] REN D Y, LI Y F, ZHAO F M, SANG X C, SHI J Q, WANG N, GUO S, LING Y H, ZHANG C W, YANG Z L, HE G H., which encodes an AP2/ERF protein, determines spikelet meristem fate and sterile lemma identity in rice., 2013, 162(2): 872-884.

[12] SUZAKI T, SATO M, ASHIKARI M, MIYOSHI M, NAGATO Y, HIRANO H Y. The generegulates floral meristem size in rice and encodes a leucine-rich repeat receptor kinase orthologous toCLAVATA1., 2004, 131(22): 5649-5657.

[13] SUZAKI T, TORIBA T, FUJIMOTO M, TSUTSUMI N, KITANO H, HIRANO H Y. Conservation and diversification of meristem maintenance mechanism in: function of thegene., 2006, 47(12): 1591-1602.

[14] JIANG L, QIAN Q, MAO L, ZHOU Q Y, ZHAI W X. Characterization of the rice floral organ number mutant., 2005, 47(1): 100-106.

[15] CHU H W, QIAN Q, LIANG W Q, YIN C S, TAN H X, YAO X, YUAN Z, YANG J, HUANG H, LUO D, MA H, ZHANG D B. Thegene encoding a putative ortholog ofCLAVATA3 regulates apical meristem size in rice., 2006, 142(3): 1039-1052.

[16] 张向前, 邹金松, 朱海涛, 李晓燕, 曾瑞珍. 水稻早熟多子房突变体的遗传分析和基因定位. 遗传, 2008, 30(10): 1349-1355.

ZHANG X Q, ZOU J S, ZHU H T, LI X Y, ZENG R Z. Genetic analysis and gene mapping of an early flowering and multi-ovary mutant in rice (L.)., 2008, 30(10): 1349-1355. (in Chinese)

[17] 赵福永, 王洁雅, 黄显波, 邓则勤, 林成豹, 严寒, 田志宏. 水稻花器官数目突变体的研究初报. 杂交水稻, 2011, 26(2): 52-57.

ZHAO F Y, WANG J Y, HAUNG X B, DENG Z Q, LIN C B, YAN H, TIAN Z H. A preliminary study on the floral organ number mutant, 2011, 26(2): 52-57. (in Chinese)

[18] LI Y , XU P Z, ZHANG Q F, ZHANG H Y, PENG H, WANG X D, WU X J. Characterization and identification of a novel mutant() on floral organ number and floral organ identity in rice., 2007, 34(8): 730-737.

[19] ZHANG J R, TANG W, HUANG Y L, NIU X L, ZHAO Y, HAN Y, LIU Y S. Down-regulation of a-like gene,, leads to occurrence of unusual double ovules and developmental abnormalities of various floral organs and megagametophyte in rice., 2015, 66(1): 99-112.

[20] SUN Q, ZHOU D X. Rice jmjC domain-containing geneencodes H3K9 demethylase required for floral organ development., 2008, 105(36): 13679-13684.

[21] Zhang B Y, Wu S H, Zhang Y E, XU T, GUO F F, TANG H S, LI X, WANG P F, QIAN W F, XUE Y B. A high temperature-dependent mitochondrial lipase EXTRA GLUME1 promotes floral phenotypic robustness against temperature fluctuation in rice (L.)., 2016, 12(7): e1006152.

[22] CLARK S E, RUNNING M P, MEYEROWITZ E M.is a specific regulator of shoot and floral meristem development affecting the same processes as., 1995, 121(7): 2057-2067.

[23] Bleckrnann A, Weidtkamp-Peters S, Seidel C A M, Simon R. Stem cell signaling inrequires CRN to localizeto the plasma membrane., 2010, 152(1): 166-176.

[24] CLARK S E, RUNNING M P, MEYEROWITZ E M., a regulator of meristem and flower development in., 1993, 119(2): 397-418.

[25] NARDMANN J, WERR W. The shoot stem cell niche in angiosperms: Expression patterns oforthologues in rice and maize imply major modifications in the course of mono- and dicot evolution., 2006, 23(12): 2492-2504.

[26] ZENG D D, QIN R, ALAMIN M, LIANG R, YANG C C, JIN X L, SHI C H.specifies palea development by suppressing the expansion of the margin of palea in rice., 2016, 38(11): 1095-1103.

[27] 钱春荣, 王俊河, 冯延江, 王麒, 于洋, 宫秀杰. 不同浸种时间对水稻种子发芽势和发芽率的影响. 中国农学通报, 2008, 24(9): 183-185.

QIAN C R, WANG J H, FENG Y J, WANG Q, YU Y, GONG X J.Effects of different soaking time on germination potential and germination rate of rice seeds., 2008, 24(9): 183-185. (in Chinese)

[28] MURRAY M G, THOMPSON W F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA., 1980, 8(19): 4321-4326.

[29] MCCOUCH S R, CHEN X L, PANAUD O, TEMNYKH S, XU, Y B, CHO, Y G, HUANG N, ISHII T, BLAIR M. Microsatellite marker development, mapping and applications in rice genetics and breeding., 1997, 35(1): 89-99.

[30] CAI Q, YUAN Z, CHEN M J, YIN C S, LUO Z J, ZHAO X X, LIANG W Q, HU J P, ZHANG D B. Jasmonic acid regulates spikelet development in rice., 2014, 5: 3476.

[31] LEE D Y, LEE J, MOON S, PARK S Y, AN G. The rice heterochronic generegulates the transition from spikelet meristem to floral meristem., 2007, 49(1): 64-78.

（责任编辑 李莉，岳梅）

Phenotypical Analysis and Gene Mapping ofabnormal floral organ number MutantL.)

YANG ChengCong, LIANG Rong, QIN Ran, ZENG DongDong, JIN XiaoLi, SHI ChunHai

(Department of Agronomy, College of Agriculture and Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou 310058)

The abnormal floral organ number mutant of rice was used to study the molecular mechanisms of floral organ development, and to identify the related genes of floral organ in rice.In present study, a rice mutant,() was isolated from ancultivar Zhenong 34 M2population by mutagenesis with ethyl methane sulfonate (EMS). At flowering stage, five panicles fromand Zhenong 34 were randomly selected to observe the morphological phenotype, cytological features and pollen fertility by histology analysis and scanning electron microscopy, respectively. At mature stage, ten plants fromand Zhenong 34 were randomly chosen for measuring the main agronomic traits, such as plant height, number of tillering, panicle length, number of floret per panicle, number of filled grain per panicle and 1 000-grain weight.One hundred plump seeds were selected for calculating the germination potential and germination rate of the mutantand wild type. The F2population from crossing ofwith WT Zhenong 34 and Zhenongda 104 were used for genetic analysis and gene mapping, respectively. Then, the DNA sequencing was conducted, the model of AFON1 protein was built and the space structure for AFON1 protein was analyzed. Moreover, the expression of candidate gene and floral organ number associated genes were detected by real-time PCR.Compared with the wild type, the floral organ number of 59.64% spikelet was abnormal in mutant, which most of them had a glume-like organ on the side of the leman and there were 2-4 rounds of floral organ number increased at the same time in others. Furthermore, the plant height and 1 000-grain weight ofwere visibly higher, while the seed setting rate was significantly reduced. The results of the genetic analysis showed that the phenotype of F1population from the crossing ofwith Zhenong 34 was normal and the segregation ratio of wild-type and mutant phenotype plants from F2population fitted a ratio of 3﹕1, which revealed that the mutant trait ofwas controlled by a single recessive nuclear gene. Thewas further mapped on the arm of chromosome 1 between InDel markers 1M5 and 1M18 with a physical distance of 73 kb, where there were 6 annotated genes. The sequencing results between the mutantand the wild type illustrated that there was a single base-pair substitution of T (565th) to A on the exon ofresulting in the mutation of Trp (189th) to Arg. Protein sequencing and structure analysis revealed that there was a Lipase_3 domain and the mutation in the region changed the space structure of AFON1 obviously. The real-time PCR result showed that the expression ofnumber related genesand/was obviously increased in floral organ at young panicle developmental stage.Thewas speculated as the generegulating the number of floral organ by influencing the expression of corresponding genes which determined the number of floral organ.

rice;(); gene mapping; expression analysis

2017-03-21；接受日期：2017-05-18

浙江省重大科技攻关专项（2012C12901-2）、浙江省科技厅公益技术应用研究计划（2016C32085）、高等学校学科创新引智计划（Grant B14027）、教育部创新团队资助项目（IRT1185）

杨成聪，Tel：18758122705；E-mail：chengcongyang@zju.edu.cn。通信作者石春海，Tel/ Fax：0571-88982691；E-mail：chhshi@zju.edu.cn