油菜RbohB基因的克隆及逆境响应表达分析

张腾国 罗丹瑜 郭艳峰 郑 晟 王 娟

(西北师范大学生命科学学院，兰州 730070)

油菜RbohB基因的克隆及逆境响应表达分析

张腾国 罗丹瑜 郭艳峰 郑 晟 王 娟

(西北师范大学生命科学学院，兰州 730070)

利用RACE技术从‘陇油6号’油菜中克隆得到一个新的RbohB基因，全长2 694 bp，开放阅读框2 541 bp，编码846个氨基酸。实时荧光定量PCR分析表明RbohB基因表达受低温、高盐、H2O2诱导，MAPKK抑制剂U0126预处理12 h再经低温、高盐、H2O2诱导，与单独处理结果相比，RbohB基因表达明显降低，表明该基因在油菜适应低温、高盐、H2O2胁迫过程中发挥作用，U0126对该基因的转录有抑制作用。NADPH氧化酶活性受H2O2处理的诱导，U0126预处理12 h再经H2O2处理，与单独H2O2处理结果相比，NADPH氧化酶活性明显降低，表明MAPKK抑制剂U0126对该酶活性有抑制作用。

油菜；RbohB基因；分子克隆；表达分析

近年来的研究结果表明，NADPH氧化酶活性除了受到Ca2+、钙依赖蛋白激酶(CDPK)、RacGTP酶的调节外，MAPK级联信号传导途径在NADPH氧化酶活性调节过程中同样发挥着重要的作用。MAP激酶级联途径是真核细胞中将外源信号转变为胞内响应的重要途径之一，该途径广泛参与氧爆发的信号过程[9]。玉米叶肉细胞中干旱和ABA诱导的抗氧化保护依赖于H2O2的产生和MAPK的活性[10]。烟草中MEK2-SIPK/NTF4级联可以调节活性氧的产生[6]。H2O2可以激活拟南芥中的MAPK激酶ANP1，ANP1，又可以激活下游的MPK3/MPK6[11]。进一步的研究表明，MAPK级联信号传导途径调节氧爆发的信号过程通过调节NADPH氧化酶活性的过程而实现。如烟草中MAPK激酶级联途径MEK2-SIPK/NTF4和MEK1-NTF6调节依赖于NADPH氧化酶的氧爆发，进而影响着烟草对病原体侵染的抵抗力[6]。在番茄中油菜素内酯诱导产生H2O2，H2O2进一步激活番茄中的MAP激酶MPK2，有活性的MPK2反过来上调Rboh基因的表达、H2O2的积累以及植物的抗胁迫响应[12]。番茄中NADPH氧化酶的激活导致质外体H2O2的积累，H2O2诱导激活MPK1/2，有活性的MPK1/2进一步诱导各种胁迫响应[13]。这些研究结果表明，在ROS产生过程中，Rboh的转录激活及翻译后调节是MAP激酶级联途径的功能之一。以上关于MAP激酶级联途径参与NADPH氧化酶(Rboh)的转录激活及翻译后调节的研究主要集中在ABA、油菜素内酯诱导以及病原体侵染等领域，那么在低温、干旱以及高盐等非生物胁迫条件下，MAP激酶级联途径与Rboh之间是否也存在类似的调解关系，目前还没有相关报道。

油菜是重要的油料作物，白菜型冬油菜新品种‘陇油6号’是一种超强抗寒性品种，适应于极端低温为-20℃～-30℃的中国北方旱区、寒区种植，是目前能在甘肃省中北部与河西地区安全越冬的冬油菜品种。本研究以‘陇油6号’为研究材料，克隆RbohB基因，在低温、高盐、H2O2单独处理，以及结合MAPKK专一性抑制剂U0126预处理情况下，对该基因的表达进行分析，并对H2O2单独处理，以及结合MAPKK专一性抑制剂U0126预处理情况下，对NADPH氧化酶基因活性变化进行了分析，以期对RbohB基因在植物抗逆胁迫中的作用机制提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料及处理

‘陇油6号’和‘天油2号’油菜种子由甘肃农业大学提供。选取饱满的‘陇油6号’和‘天油2号’油菜种子，用水浸泡约20 min后种于预先浸透Hoagland营养液的混合营养土中，每盆约6～8粒种子，置于室温条件下培养，光周期为14 h/10 h(光照/黑暗)，光照强度130 μmol·m-2·s-1，相对湿度50%～60%。挑选一月龄长势相同的幼苗用于后续基因克隆及逆境胁迫处理。

低温处理：选取长势良好的两种油菜幼苗置于4℃低温诱导，分别在处理0、12、24、36、48 h后剪取幼嫩叶片，液氮冷冻，用于RNA的提取。NaCl处理：Hoagland营养液配制成不同浓度的NaCl溶液(0、50、100、150、200 mmol·L-1)，浸泡同批生长的油菜幼苗36 h后剪取幼嫩叶片，液氮冷冻，用于RNA的提取。H2O2处理：Hoagland营养液配制成不同浓度的H2O2溶液(0、5、10、15、20 mmol·L-1)，浸泡同批生长的油菜幼苗24 h后剪取幼嫩叶片，用于RNA的提取及NADPH氧化酶活性的测定。专一性MAPKK抑制剂U0126经预处理后再逆境处理：将离体幼苗用蒸馏水清洗，放入水中2 h以抵消伤害胁迫，然后放入10 μmol·L-1MAPKK抑制剂U0126的溶液中预处理12 h，再进行各种逆境处理，低温处理为4℃处理18 h后剪取幼嫩叶片用于RNA的提取，盐处理为100 mmol·L-1NaCl溶液中处理24 h后剪取幼嫩叶片用于RNA的提取，H2O2处理为10 mmol·L-1H2O2溶液中处理18 h后剪取幼嫩叶片用于RNA的提取及NADPH氧化酶活性测定。将蒸馏水处理作为对照。

1.2 实验方法

1.2.1 油菜RbohB基因的克隆

RbohB基因中间片段克隆，从Genbank下载已经克隆得到的多种植物RbohB序列(包括拟南芥、玉山筷子芥、高山离子芥、独行菜、甘蓝等)，用DNAstar软件Editseq模块进行序列编辑，MegAlign模块进行序列比对,根据比对结果，设计简并引物RB-U和RB-D(表1)。选取生长良好的‘陇油6号’油菜，利用Trizol试剂进行油菜叶片总RNA的提取，反转录得到相应的cDNA，按照大连宝生物工程公司的Premix Ex Taq DNA Polymerase操作说明书于25 μL反应体系进行PCR扩增。扩增产物按照EasyPure Quick Gel Extraction Kit回收试剂盒(离心柱型)(购自全式金公司)回收，回收产物连入pTG19-T载体，转化感受态大肠杆菌Trans 5α，过夜培养，随机挑取若干白斑菌落进行PCR及酶切鉴定，鉴定为阳性克隆后送华大基因公司测序。

表1 PCR引物序列

RACE方法克隆RbohB基因全长，以提取得到的‘陇油6号’油菜的总RNA为材料，分别按照TakaRa公司3′-Full RACE试剂盒和Invitrogen公司5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends,Version 2.0试剂盒操作方法进行RACE扩增。3′RACE根据已得到的油菜RbohB的中间片段序列设计两个基因特异性引物RB3′I和RB3′O(表1)，试剂盒中自带的引物3′RACE Outer Primer和3′ RACE Inner Primer(表1)作为匹配的下游引物。油菜总RNA按照试剂盒操作说明反转录得到cDNA，用引物RB3′O和3′RACE Outer Primer进行一扩PCR，以一扩PCR产物为模板，用引物RB3′I和3′RACE Inner Primer进行二扩PCR。将扩增得到的预期大小的片段用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(离心柱型)(购自全式金公司)进行切胶回收，连接入pTG19-T载体，转化大肠杆菌Trans5α，筛选阳性克隆，测序。5′RACE根据已得到的油菜RbohB的中间片段序列设计两个基因特异性引物RB5′O和RB5′I(表1)。试剂盒中自带的引物AAP和AUAP(表1)作为匹配的上游引物。按照试剂盒操作说明将总RNA反转录合成cDNA，用引物RB5′O和AAP进行一扩PCR，以一扩PCR产物为模板，用引物RB5′I和AUAP进行二扩PCR。扩增产物纯化回收后连入pTG19-T载体，转化大肠杆菌Trans5α，筛选阳性克隆，测序。

1.2.2 油菜RbohB预测蛋白质的生物信息学分析

应用DNAstar软件Megalign模块进行氨基酸序列的比对，用ClustalW方法进行预测氨基酸序列同源性分析；以氨基酸序列为基础用Clustal方法构建了系统进化树；应用TopPred对油菜RbohB预测蛋白的疏水性进行在线分析；用SOPMA对油菜RbohB蛋白的二级结构进行在线预测。

1.2.3油菜RbohB基因表达的实时荧光定量PCR检测

提取‘陇油6号’和‘天油2号’油菜茎、叶、下胚轴的mRNA，以反转录得到的cDNA为模板，根据实时荧光定量PCR的方法，检测油菜RbohB基因在不同组织中的表达量。

经不同处理(详见1.1)后提取‘陇油6号’和‘天油2号’油菜总RNA经反转录得到cDNA作为实时荧光定量PCR模板。分别以ActinF、ActinR(表1)为管家基因引物，RBDL-U、RBDL-D(表1)为RbohB基因引物，按照大连宝生物工程公司的SYBR Premix Ex TaqTM操作说明书于25 μL反应体系进行PCR扩增，每个样品做3个重复。扩增体系为：SYBR Premix Ex TaqTM12.5 μL，上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 9.5 μL。扩增程序为：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火20 s，40个循环；55～95℃每30 s渐进升高0.5℃，81个循环。采用2-△△ct方法分析数据，确定基因相对表达量。

1.2.4 NADPH氧化酶活性的测定

NADPH氧化酶活性的测量参考植物NADPH氧化酶活性光度法定量检测试剂盒(购自上海杰美基因医药科技有限公司)产品说明书进行。

1.2.5 数据分析

测得的数据用SPSS 17.0进行分析，用Origin 9.0进行做图。

2 结果与分析

2.1 油菜RbohB基因的克隆

根据GenBank上已知的植物RbohB基因序列，分别设计简并引物，以陇油6号油菜中提取得到的总RNA反转录产物为模板，扩增得到了一条1 591 bp左右大小的单一条带(图1)，此条带和预期大小相符，将其测序结果与其他植物的RbohB基因进行序列比对分析，发现与拟南芥AtRbohB基因具有较高的同源性。因此可以初步判断，扩增产物为油菜RbohB基因片段。3′RACE扩增使用TaKaRa公司的3′-Full RACE试剂盒，扩增得到了大约1 332 bp大小的片段(图2A)。该测序结果与前面扩增得到的油菜RbohB基因部分片段进行序列比对，重叠部分的序列完全相同，说明前面克隆得到的大小为1 591 bp的片段和3′RACE扩增的片段来自于同一条基因。5′RACE扩增使用Invitrogen公司的System for Rapid Amplification of cDNA Ends,Version 2.0试剂盒，扩增得到了293 bp大小的片段(图2B)。该测序结果与之前扩增得到的油菜RbohB基因部分片段进行序列比对，重叠部分的序列完全一致，说明前面克隆得到的大小为1 591 bp的片段与5′RACE得到的片段来自于同一条基因。

将3′RACE和5′RACE获得的片段与之前扩增得到的1 591 bp的中间片段进行序列拼接，得到了一条全长为2 694 bp的基因序列，包含一个2 541 bp开放阅读框(ORF)，起始密码子ATG前5′-UTR 10 bp，终止密码子TAG后3′-UTR 143 bp，包含12 bp的polyA。该基因编码846个氨基酸(图3)，预测蛋白分子量为96.7 kD，等电点为8.4。为了保证获得的油菜RbohB基因拼接序列的准确性，根据该拼接序列设计一对特异性引物进行PCR扩增，扩增结果与拼接而成的序列进行比对，核苷酸组成完全一致。

图1 RT-PCR扩增油菜RbohB基因片段 M.分子量标准；1.RbohB基因片段Fig.1 RT-PCR amplification of RbohB fragment in B.campestris L. M.Marker；1.Amplification of RbohB fragment

图2 3′RACE和5′RACE PCR结果电泳图 A. 3′RACE PCR结果；B. 5′RACE PCR结果；M.分子量标准；1.RACE结果Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR product of 3′RACE and 5′RACE A. PCR product of 3′RACE；B. PCR product of 5′RACE；M.Marker；1.PCR product of RACE

2.2 油菜RbohB预测蛋白的生物信息学分析

从Genbank中下载已经克隆得到的其他植物RbohB基因序列，利用DNAStar软件，将所有基因的CDS区导入Megalign模块，用ClustalW方法进行氨基酸序列的比对，预测同源性分析。发现油菜RbohB与拟南芥AtRbohB(NM_202070)、亚麻荠CsrbohB(XM_010459875)的同源性分别为86.7%、87%。同时，对拟南芥、亚麻荠等RbohB蛋白质序列进行聚类分析，并构建系统进化树，结果显示(图4)，油菜RbohB与拟南芥AtRbohB、亚麻荠CsrbohB的亲缘关系较近。油菜RbohB与AtRbohB、CsrbohB均具有6个跨膜结构域(TMDⅠ-TMDⅥ)、FAD结合结构域、NADPH结合结构域，N-末端都含有2个可以结合Ca2+的EF手性模体结构(EF-hand)(图5)。应用TopPred(http://mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.py?#forms::toppred)对油菜RbohB预测蛋白的疏水性进行在线分析表明，该蛋白有6个跨膜结构。用SOPMA对油菜RbohB蛋白的二级结构进行在线预测，结果显示：油菜RbohB包含44.09% α-螺旋(Alpha helix)、19.98%延伸链(Extended strand)、8.87%β-转角(Beta turn)和27.07%不规则卷曲(Randomcoil)，油菜RbohB蛋白主要以α一螺旋和不规则卷曲为主。

图3 油菜RbohB基因cDNA序列及预测的氨基酸序列Fig.3 The full-length cDNA sequence and deduced amino acid sequence of RbohB gene in B.campestris L.

2.3 油菜RbohB基因组织特异性表达检测

选取生长状态良好的‘陇油6号’和‘天油2号’油菜植株直接提取茎、叶和下胚轴总RNA，反转录后得到的cDNA作为实时荧光定量PCR的模板。实时荧光定量PCR结果(图6)表明，RbohB在油菜茎、叶和下胚轴中均表达，叶表达量最高，下胚轴其次，茎最弱。

图4 油菜RbohB与部分植物RbohB基因的系统进化树Fig.4 The phylogenetic relationship of the RbohB with RbohB from other plant species

图5 油菜RbohB与其它植物RbohB氨基酸序列比对 *.FAD结合结构域；#.NADPH结合结构域Fig.5 Alignment of the B.campestris L. RbohB with RbohB from other plant species *.Represents the FAD binding domain；#.Represents the NADPH binding domain

图6 RbohB基因在不同组织中的表达Fig.6 The expression of RbohB gene in different tissues

图7 不同处理下油菜RbohB基因的表达 A.低温(4℃)胁迫；B.盐(NaCl)胁迫；C. H2O2胁迫Fig.7 The expression of RbohB genes of B.campestris L. under different treatments A. Low temperature(4℃) stress; B. Salt(NaCl) stress; C. H2O2 stress

2.4逆境胁迫下油菜RbohB基因在转录水平上的表达分析

低温胁迫处理对油菜RbohB转录水平的影响，为了分析油菜RbohB基因在油菜抗低温胁迫中的作用，以‘陇油6号’和‘天油2号’两种油菜叶片为材料，对其在低温胁迫前后RbohB基因的表达情况进行分析。实时荧光定量PCR结果显示：油菜RbohB基因的表达受4℃低温胁迫诱导，经4℃低温处理12、24、36、48 h后，两种油菜中RbohB基因的表达整体上呈现先升高后降低的趋势。‘陇油6号’油菜RbohB基因转录水平分别提高到对照组的2.296、3.64、3.114、2.364倍，于24 h达到最大值。‘天油2号’油菜RbohB基因的相对表达量分别是对照的1.422、1.227、0.993、0.903倍，于12 h达到最大值(图7A)。就RbohB基因的表达量增长趋势而言，‘陇油6号’油菜较‘天油2号’更明显，表明RbohB基因在‘陇油6号’油菜中受低温胁迫诱导的程度更强，这与‘陇油6号’油菜比‘天油2号’更具有抗寒性的生理特性一致。

盐胁迫处理对RbohB转录水平的影响，实时荧光定量PCR实验结果表明：油菜RbohB基因的表达明显受盐胁迫的诱导。在不同浓度(50、100、150、200 mmol·L-1)盐溶液处理36 h后，‘陇油6号’油菜RbohB基因的转录水平随着盐溶液浓度的增大呈现先上升后下降的趋势，且其相对表达量较对照均有明显的提高，分别提高到对照的3.411、24.59、12.042、3.16倍，并于100 mmol·L-1达到最大值。‘天油2号’油菜中，RbohB基因的相对表达量所呈现的变化趋势与‘陇油6号’基本一致，但幅度较小，分别是对照的1.905、2.189、3.945、3.16倍(图7B)。说明RbohB基因在油菜抗盐胁迫反应中发挥作用，在同样强度的盐胁迫条件下，‘陇油6号’RbohB基因的相对表达量要比‘天油2号’的表达量高。

H2O2胁迫处理对RbohB转录水平的影响，实时荧光定量PCR结果表明：RbohB基因的表达受H2O2胁迫的诱导。在不同浓度(5、10、15、20 mmol·L-1)H2O2溶液中处理24 h后，‘陇油6号’油菜中RbohB基因转录水平随着H2O2浓度的增大而呈现依次升高的趋势，分别是对照的0.878，2.297，3.117，3.643倍，于20 mmol·L-1达到了最大值。‘天油2号’油菜中，随着处理浓度的增大，表达量较对照有不同程度的增强，呈现先升高后降低的趋势，只是变化幅度较小，在15 mmol·L-1达到最大值(图7C)。在同样强度的H2O2胁迫作用下，‘陇油6号’油菜RbohB基因表达量比‘天油2号’的表达量高，表明RbohB基因在‘陇油6号’油菜中比‘天油2号’油菜中受H2O2胁迫诱导程度较强。

图8 MAPKK抑制剂U0126预处理下油菜RbohB基因的表达 A.U0126预处理再低温(4℃)胁迫；B.U0126预处理再盐(NaCl)胁迫；C.U0126预处理再H2O2胁迫Fig.8 The expression of RbohB genes of B.campestris L. under MAPKK inhibitor U0126 pretreatment A. U0126 pretreatment and then low temperature(4℃) stress; B. U0126 pretreatment and then salt(NaCl) stress; C. U0126 pretreatment and then H2O2 stress

2.5MAPKK抑制剂预处理对逆境胁迫下油菜RbohB基因转录水平的影响

实时荧光定量PCR结果表明：4℃低温处理18 h后，‘陇油6号’和‘天油2号’两种油菜RbohB转录水平分别提高到对照的5.579、4.724倍，在经过MAPKK抑制剂U0126预处理再4℃处理后，‘陇油6号’和‘天油2号’油菜中RbohB基因的转录水平分别提高到各自对照的3.364、2.412倍，较各自单独4℃低温处理均有明显降低(图8A)；100 mmol·L-1NaCl溶液中处理24 h后，‘陇油6号’和‘天油2号’油菜中RbohB基因转录水平分别提高到各自对照的6.233、1.647倍，在经过MAPKK抑制剂U0126预处理再100 mmol·L-1NaCl溶液中处理24 h后，‘陇油6号’和‘天油2号’油菜中RbohB基因的转录水平分别为各自对照的1.569、0.48倍，较各自单独盐处理均有明显降低(图8B)；10 mmol·L-1H2O2溶液中处理18 h后，‘陇油6号’和‘天油2号’油菜RbohB基因的转录水平分别提高到各自对照的23.425、7.944倍，MAPKK抑制剂U0126预处理12 h再转入10 mmol·L-1H2O2溶液中处理18 h后，‘陇油6号’和‘天油2号’油菜中RbohB基因的转录水平分别为各自对照的11.081、0.525倍，较各自单独H2O2溶液处理均有明显降低(图8C)。以上结果说明MAPKK抑制剂U0126预处理抑制了低温、盐以及H2O2胁迫对油菜RbohB基因的诱导，造成其转录水平降低。

2.6H2O2胁迫下两种油菜叶片中NADPH氧化酶活性的变化

在不同浓度H2O2胁迫处理24 h后，‘陇油6号’油菜中NADPH氧化酶的活性随着处理浓度的增大而升高，与对照相比，差异达到极显著水平(P<0.01)。‘天油2号’油菜中则呈现出先升高后降低的趋势，并于20 mmol·L-1时NADPH氧化酶活性迅速下降。在同一胁迫浓度下，‘陇油6号’油菜中NADPH氧化酶的活性均高于‘天油2号’(图9)，这与不同浓度H2O2处理下，两种油菜中RbohB基因转录水平的实时荧光定量PCR结果是一致的。

图9 H2O2胁迫下油菜NADPH氧化酶活性的变化 *,#.每个处理与对照之间在P<0.05水平差异显著；**,##.每个处理与对照之间在P<0.01水平差异显著 下同。Fig.9 Changes of NADPH oxidase activity of B.campestris L. under H2O2 stress *,#.Indicates that the difference between each treatment and the control at P<0.05 is significant; **,##.Indicates that there is a significant difference in P<0.01 between each treatment and control The same as below.

2.7MAPKK抑制剂预处理对H2O2胁迫下油菜NADPH氧化酶活性的影响

10 mmol·L-1H2O2溶液中处理18 h后，‘陇油6号’油菜中NADPH氧化酶活性升高到对照的126%，‘天油2号’中升高到对照的121%，差异均达到极显著水平(P<0.01)。经U0126预处理12 h再H2O2胁迫处理18 h后，两种油菜中NADPH氧化酶的活性较H2O2单独处理均有不同程度的下降，其中‘陇油6号’油菜中较对照降低了23.4%，‘天油2号’中则降低到对照的36.3%，差异达到显著性水平(P<0.05)(图10)。说明两种油菜中NADPH氧化酶的活性均受H2O2胁迫的诱导而有所升高，但经过MAPKK专一抑制剂U0126预处理后，其活性有不同程度的降低，这与H2O2胁迫及MAPKK抑制剂预处理后再H2O2胁迫条件下，两种油菜中RbohB基因转录水平的实时荧光定量PCR结果一致。

图10 MAPKK抑制剂预处理下油菜NADPH氧化酶活性的变化Fig.10 Changes of NADPH oxidase activity of B.campestris L. under MAPKK inhibitor pretreatment

3 讨论

NADPH氧化酶本身最早发现于人免疫系统的吞噬细胞，是一个异源多聚体蛋白。在植物应答生物胁迫和干旱、冷、紫外照射、ABA以及重金属过量或缺乏等非生物胁迫反应时，质膜NADPH氧化酶通过短时间内大量产生信号分子活性氧(ROS)调节基因表达和细胞的新陈代谢，使植物及时应对逆境胁迫作出反应，以适应环境的变化。本研究从‘陇油6号’油菜中克隆得到了含完整编码序列的NADPH氧化酶RbohB基因，序列分析表明油菜RbohB基因和其他植物中已克隆得到的RbohB基因同源性很高。油菜RbohB基因具有6个跨膜结构域，FAD结合结构域和NADPH结合结构域，两个可以结合Ca2+的EF手性模体。

不同逆境胁迫可以诱导Rboh表达，调节NADPH氧化酶活性，如禾白粉病菌通过刺激大麦HvrbohA基因表达，上调NADPH氧化酶活性，进一步通过H2O2信号增强植物对病菌体的抗性[14]。外源ABA处理可以激活Rboh基因的转录，提高其转录活性，从而诱导一定量ROS的产生，ROS又可作为信号分子进一步激活Rboh基因的转录，其结果是形成了一种信号放大机制，即由Rboh介导的ROS信号传导途径[15]。本研究表明，低温、高盐、H2O2胁迫都能不同程度地诱导两种油菜RbohB基因的表达，说明RbohB基因在油菜抵御非生物胁迫的过程中发挥了作用。已有研究显示H2O2可以活化植物的MAPK且延长MAPK活化时间可以导致氧爆发，这些结果说明在ROS和MAPK级联之间可能存在着一种交叉机制[16]。MEK2-SIPK/NTF4和MEK1-NTF6两条MAPK级联途径调节着激发子INFI，它可以诱导烟草RbohB依赖性氧爆发，而且这种调节机制激活Rboh基因的表达主要是在转录水平上[6]。Zhang等[17]研究结果表明，油菜素内酯诱导产生的H2O2可以激活MAP激酶ZmMPK5，被激活的ZmMPK5又可以诱导NADPH氧化酶基因的表达，进而进一步提高H2O2的积累。因此，MAPK级联系统在ROS产生过程中的一个作用可能就是在转录水平激活Rboh基因的表达。MAPK信号级联系统同时位于ROS的上下游，提示在MAPK与Rboh之间可能存在一个正反馈机制。

本研究结果表明，MAPKK抑制剂U0126预处理12 h后再分别进行低温、高盐、H2O2胁迫处理，其结果与各自单独低温、高盐、H2O2胁迫处理结果相比较，发现RbohB基因在两种油菜中的转录水平都明显降低。不同浓度H2O2处理后，两种油菜中NADPH氧化酶活性均有不同水平的升高，而MAPKK抑制剂U0126预处理再经H2O2处理后，两种油菜中NADPH氧化酶的活性较单独H2O2处理的结果均有所降低，这表明U0126对NADPH氧化酶的活性具有抑制作用。不论是在油菜RbohB基因的转录水平还是NADPH氧化酶活性水平上，MAPKK抑制剂U0126对二者均有抑制作用，因此推测油菜RbohB基因的转录及表达可能与由MAPKKK→MAPKK→MAPK构成的MAP激酶信号传导途径具有一定的相关性，即受到MAPK级联途径的调控，而且是某种正调控机制。

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The National Natural Science Foundation of China(31460099)

introduction：ZHANG Teng-Guo(1971—),male,Dr.,professor,Mainly engaged in the study of physiological and molecular biology.

date:2016-12-19

CloningandExpressionAnalysisofRbohBGeneinBrassicacampestrisL.

ZHANG Teng-Guo LUO Dan-Yu GUO Yan-Feng ZHENG Sheng WANG Juan

(School of Life Sciences,Northwest Normal University,Lanzhou 730070)

A novelRbohBgene was isolated fromBrassicacampestrisL. Longyou 6 by RACE. The full-length cDNA ofRbohBis 2 694 bp, with open reading frame (ORF) 2 541 bp, encoding a 846 amino acid protein. By RT-PCR analysis, transcript level ofRbohBwas increased in response to cold, high salt and H2O2stress. However, MAPKK inhibitor U0126 pretreatment 12 h before cold, high salt and H2O2stress, compared with the single stress, the expression level ofRbohBwas significantly decreasing. The results suggested thatRbohBplayed an important role during cold, high salt and H2O2stress inB.campestrisL. and U0126 has inhibitory effect toRbohBgene transcription. The activity level of NADPH oxidase was increased in response to H2O2stress. However, U0126 pretreatment 12 h before H2O2stress, compared with the single H2O2stress, NADPH oxidase activity was significantly decreasing. The result showed that MAPKK inhibitor U0126 has inhibitory effect to NADPH oxidase activity.

BrassicacampestrisL.;RbohBgene;molecular cloning;expression analysis

国家自然科学基金(31460099)

张腾国(1971—)，男，博士，教授，主要从事抗逆生理及分子生物学研究。

2016-12-19

S565.4

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.05.016