芦笋提取液对α—葡萄糖苷酶抑制作用的研究

赵琳琪+黄嬛+刘紫薇+汪淑贞

摘 要：目的 研究芦笋提取液对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，探索总多酚类化合物在治疗糖尿病方面的价值。方法 以芦笋为原料，将粉碎、提取及大孔吸附树脂处理得到的芦笋提取液用Folin- 酚法进行总多酚含量测定及 α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定。 结果 芦笋提取液对α-葡萄糖苷酶有抑制作用，半数抑制量（ IC50 ）为mg /mL。 结论 芦笋提取液对α-葡萄糖苷酶有一定抑制作用。

关键词：芦笋 α-葡萄糖苷酶 总多酚 糖尿病

Study on the Inhibitory Effect ofAsparagus Extract on α - Glucosidase

Abstract： Objective To study the inhibitory effect of asparagus extract on α-glucosidase and to explore the value of total polyphenols in the treatment of diabetes mellitus. Methods Asparagus was used as raw material， the extraction of polyphenols and the determination of α-glucosidase inhibitory activity were determined by Folin-phenol method， which was obtained by pulverization， extraction and macroporous adsorption resin. Results The asparagus extract had inhibitory effect on α-glucosidase， and the half inhibitory dose （IC50） was mg / mL. Conclusion Asparagus extract has a certain inhibitory effect on α-glucosidase.

Keywords： Asparagus； α-glucosidase； Total polyphenols； Diabetes mellitus

中图分类号：R151 文献标识码：A 文章编号：1003-9082（2017）09-0-02

芦笋，学名石刁柏，是百合科天门冬属多年生宿根性草本植物，原产于地中海沿岸和小亚细亚一带，现在全国各地均有栽培。《中华本草》记载，芦笋含有皂苷类、黄酮类及各种氨基酸[3]。芦笋中含有丰富的各类营养和功能成分而越来越受人们的欢迎。目前，芦笋的生物学功能的研究受到广泛关注，因含有丰富的黄酮和多酚化合物而具有很强的抗氧化活性，在抗肿瘤、调节血糖血脂[4-7]等方面也有相关研究报道。

α-葡萄糖苷酶抑制剂是一类新型的口服降血糖药物，可有效抑制小肠体内的 α-葡萄糖苷酶活性，使摄取寡糖、多糖等消化后变成葡萄糖、果糖等单糖的过程受到阻碍，从而降低血糖水平[5-7]，但是，目前用于临床的 α-葡萄糖苷酶抑制剂（阿卡波糖等）都存在一定的副作用[5]，因此，更安全和有效的天然 α-葡萄糖苷酶抑制剂有待人们进一步探索研究开发。

据报道，服用新鲜芦笋能够降低患者血糖[6]，而抑制小肠α一葡萄糖苷酶活性是药物降血糖机理之一。本实验以芦笋嫩茎为原料，采用正交试验优化多酚提取的工艺条件[8]，研究芦笋提取液中多酚对α一葡萄糖苷酶活性的影响从而探寻其对α-葡萄糖苷酶抑制作用，初步探究芦笋提取液中的多酚对降血糖的作用功效。

一、材料和方法

1.材料与仪器

芦笋粉 芦笋（购自蔬菜批发市场）洗净，烘干，磨成粉后过60目筛。

对硝基苯酚（PNP，山东西亚化学有限公司），对硝基苯-a-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG，上海金穗生物科技有限公司），沒食子酸对照品（上海金穗生物科技有），α-葡萄糖苷酶（源叶生物），福林酚，（上海金穗生物科技有限公司），阿卡波糖片（拜耳医药保健有限公司·中国北京，国药准字H19990205，批号BJ31754），其余试剂均为国产分析纯。

电热恒温水浴锅 上海百典仪器设备有限公司；紫外分光光度计 济南海能仪器股份有限公司；电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；全波长酶标仪 Thermo Fisher；旋转蒸发仪 德国Heidolph

2.实验方法

2.1样品制备

芦笋细粉（过60目筛）与50%乙醇在料液比1：15， 80℃水浴条件下提取60min[4]。

醇沉法按样品、乙醇体积比1：10加入乙醇，静置24小时，离心后，过滤取滤液。滤液过AB-8色谱柱。

2.2总多酚含量测定

称取 3.75 gNa2CO3， 溶于25 mL 温水， 混匀， 冷却， 定容至50mL ，得7.5%Na2CO3溶液。称取 0.110 g没食子酸对照品， 用蒸馏水溶解、定容至 100 mL ， 得溶液质量浓度为 1 000 mg/L得母液 。分别吸取此溶液 0.0、1.0、2.0、3.0 、 4.0 、 5.0 mL 至 100 mL 容量瓶中， 用蒸馏水定容， 所得没食子酸标准溶液的质量浓度分别为0.0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL 。

吸取0.5ml不同浓度的没食子酸标准溶液，加2.5ml福林酚显色剂，反应5min，再加2.0ml7.5% Na2CO3溶液，摇匀，显色，在765nm波长下测定OD值，得没食子酸标准曲线方程：y=11.886x+0.0055（R2=0.9997），其中y为吸光度，x为浓度。endprint

测定样品中总多酚含量，按上诉方法测定样品OD值，根据没食子酸标准曲线求得样品中的多酚含量[8]。

2.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性测定

2.3.1PNP标准曲线的绘制

精确称取0.0695g對硝基苯酚（PNP），用0.01mol/L磷酸缓冲液（pH为6.8）溶解并定容至25mL，即得20mmol/L母液。用蒸馏水将母液稀释成浓度分别为1、5、10、20、40、80和100μmol/L的标准溶液。取1.0mL上述标准液，各加入1.5mL 7.5%的Na2CO3溶液，混匀 1 min ，在405 nm处测定其吸光度[7]，得标准曲线方程：y=0.1146x-0.0232（R2 =0.9995），其中y 为吸光度，x为浓度。

2.3.2芦笋提取液对α-葡萄糖苷酶抑制活性的测定

探索最佳反应体系，条件优化后为：加入7 U·mL -1 的α-葡萄糖苷酶200μL，样品溶液100μL， 37 ℃恒温10 min，加入2.5 mmol·L -1 的PNPG 200μL， 37 ℃恒温反应20min，再加入800μL 0.2 mol·L -1 的Na 2 CO 3 溶液，于405nm波长下测OD值。实验共设3个组，分别为：A1（酶+样品），A2（PBS+样品），A3（酶+PBS），每组做三组平行。计算其抑制率及IC50值[9-11]。

3.酶促动力学分析

在其他反应条件不变，改变底物浓度，分别为2.5mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L，加或不加芦笋提取液的条件下测定酶促反应速度 ，以1/V为纵坐标，1/[S]为横坐标作图 ，得到Lineweaver‐Burk曲线。

二、结果与讨论

1.结果

1.1芦笋提取液中多酚含量

经处理后得到的芦笋提取液用Folin- 酚法测得其中多酚的含量为3.46mg/g。

1.2 芦笋提取液对 α‐葡萄糖苷酶的抑制效果

在试验浓度（0.025～0.116mg/mL）范围内 ，芦笋提取液对α-葡萄糖苷酶有明显的抑制作用，且两者呈一定的量效关系，即随着提取液中多酚含量的升高抑制效果也随之变大。芦笋提取液对α-葡萄糖苷酶的半抑制浓度为0.042mg/mL。（图1）

1.4石榴花多酚对 α-葡萄糖苷酶抑制作用的动力学分析

α-葡萄糖苷酶的浓度不变 ，在添加或不添加芦笋提取液（0.061mg/mL）条件下 ，改变底物PNPG 的浓度（2.5～10mmol/L），测定不同PNPG 浓度下反应体系的反应速率，得到 α-葡萄糖苷酶在有无芦笋提取液存在时的 Lineweaver‐Burk 曲线 。 和未添加芦笋提取液时相比 ，当芦笋提取液存在时 ，α-葡萄糖苷酶酶催化的酶促反应的 Km变大 ，但 Vmax 基本不变 ，因此推测芦笋提取液对α-葡萄糖苷酶为竞争性抑制作用类型[12]（图2）

2.讨论

相关性分析表明，芦笋提取液对α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用，在底物浓度为5mmol/L 条件下 ，0.116mg/mL浓度的芦笋提取液对α-葡萄糖苷酶的抑制率可达到94.62%。。 Lineweaver‐Burk 曲线显示其为竞争性抑制作用类型。同时，芦笋提取液中多酚含量与α-葡萄糖苷酶抑制活性呈较明显的正相关关系，因此芦笋提取液中的多酚可能具有较强的抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用。可以对该提取物做进一步的研究。本实验表明芦笋提取物在降血糖等方面具有良好的开发应用前景，对糖尿病的治疗和预防有积极有效的作用，可将芦笋制成易储藏的芦笋汁作为糖尿病患者的保健食品等，同时也为开发天然的α-葡萄糖苷酶抑制剂产品提供了理论依据。

参考文献

[1]叶木荣 . 芦笋汁的药理研究[ J] . 中国中药杂志 ， 1994 ， 19（ 4） ： 240-242 .

[2]袁仲刘新社芦笋的保健功能与加工利用[J].食品研究与开发，2008，29（8）：158

[3]Editor Committee of National Chinese Medical Manage Bu-reau“Chinese Herb”（国家中医药管理局《中华本草》编委会）.Traditional Chinese Medicine Volume 8（中华本草，第8卷）.Shanghai：Shanghai Science Technology），House，1999.7.

[4]Sun T，Powers JR，Tang J.Evaluation of the antioxidant activity of asparagus，broccoli and their juices.Food chem，2007，105：101-106

[5] Xia J（夏俊），Chen ZW（陈治文），Shi Y（石莹）.Green asparagus extracts induce the inhibition of nucleic acid biosynthesis in tumour cells.Terat CarcinMutag （癌变·畸变·突变），2003，15：212-214

[4]Mei HS（梅慧生），Wu YQMG（乌云其木格），Wu ZY（吴仲燕）.The effects by eating asparagus spears on blood lipid levels of human body. Acta Sci Nat Univ Pek （北京大学学报，自科版），1990，26：369-373

[6]朱素英.正交实验设计优化芦笋嫩茎多酚的提取工艺[J].食品工业科技，2013.21.072endprint