芹菜素对肝细胞癌SMMC-7721细胞系干样细胞自我更新及CK2α表达的影响

姜素芳，许 畅，陈 阿，崔迎红，李 翔，曹建国

（湖南师范大学医学院药学系，长沙 410013）

芹菜素对肝细胞癌SMMC-7721细胞系干样细胞自我更新及CK2α表达的影响

姜素芳，许 畅，陈 阿，崔迎红，李 翔，曹建国

（湖南师范大学医学院药学系，长沙 410013）

目的：研究芹菜素是否能下调CK2α表达和抑制SMMC-7721细胞系肝癌干样细胞自我更新。方法：干细胞培养基超低粘附培养板悬浮培养法扩增肝癌干样细胞；肿瘤球形成法检测肝癌干样细胞的自我更新能力；Western-blot检测细胞CK2α蛋白表达水平。结果：人肝细胞癌SMMC-7721细胞系第2代球细胞具有最强自我更新潜能，可用作肝癌干样细胞模型。芹菜素以浓度依赖方式降低肝癌干样细胞的肿瘤球形成率以及CK2α蛋白表达水平。结论：芹菜素抑制肝癌干样细胞自我更新作用与其下调CK2α表达相关。

芹菜素；肝细胞癌；自我更新；CK2α

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）位列癌症相关死因第三位，且发病率逐年上升，现有的治疗方法对其治疗效果均不理想，因此，进一步研究HCC的发病机制，寻找新的治疗药物和方法对HCC的治疗至关重要。芹菜素（Apigenin）是一种广泛分布于药用植物、蔬菜和水果中的黄酮类化合物，对乳腺癌、结肠癌、卵巢癌等多种肿瘤具有预防、治疗或化疗增敏作用。魏小华等［1］研究发现：在Hep G2、Hep 3B和PLC/PRF/5肝细胞癌细胞系中，芹菜素可显著抑制细胞生长。 Seldin D等［2］的研究表明，芹菜素还可以释放肿瘤坏死因子2α（TNF2α）和干扰素γ2（IFN2γ）及诱导 caspases 活性的方式诱导 Hep G2肝癌细胞凋亡。先前的研究发现，宫颈癌HeLa源性球细胞和卵巢癌SKOV3源性球细胞高水平表达CK2α蛋白，芹菜素可通过失活CK2α抑制HeLa源性球细胞以及卵巢癌SKOV3源性球细胞自我更新能力［3，4］。 但是，芹菜素能否下调肝癌干样细胞CK2α表达抑制自我更新还有待验证。

1 材料和方法

1.1 药品与试剂

DMEM培养基、DMEM/F12培养基和胎牛血清（美国GIBCO公司），双抗（美国Invitrogen公司），重组人表皮生长因子（EGF，美国eBioscience公司），碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，美国eBioscience公司），不含维生素A的B27添加物（美国Invitrogen公司），胰岛素、芹菜素和鼠抗人β-actin单克隆抗体（美国Sigma-Aldrich公司），鼠抗人CK2α单克隆抗体（美国Millipore公司），辣根过氧化酶藕联山羊抗鼠（美国SantaCruz Biotechnology公司），增强化学发光检测试剂（美国Amersham Pharmacia Biotech公司）。

1.2 人肝癌SMMC-7721细胞培养

人肝癌SMMC-7721细胞系细胞购自中国科学院细胞库（中国，上海）。细胞系在含10% 胎牛血清、100IU/mL青霉素G和100 μg/ml链霉素的高葡萄糖DMEM细胞培养基、37°C 、饱和湿度的5% CO2培养箱中单层贴壁生长，常规3天（1：2）传代1次扩增。

1.3 肿瘤球培养

按照文献［5］所述方法，用无血清干细胞培养基（含20 ng/ml bFGF和EGF 、0.02×B27、5 μg/ml胰岛素和0.4%牛血清白蛋白的DMEM/F12培养基）悬浮，调节细胞密度为10000个/mL，每孔2.0mL接种于6孔超低粘附细胞培养板。在第3天更换新鲜干细胞培养基1次。培养6天，得到非粘附三维克隆性生长的肿瘤球，球体直径≥50.0μm。

1.4 芹菜素处理与肿瘤球形成率测定

用含不同浓度芹菜素（终浓度为5、10、20 μmol/L）或溶媒（二甲基亚砜终浓度为0.1%）干细胞培养基悬浮人肝细胞癌SMMC-7721第2代球细胞，以2000个/ml的密度每孔0.5 mL接种于24孔超低粘附培养板，第3天更换新鲜干细胞培养基1次，培养6天，获得新的肿瘤球。计数每孔肿瘤球数。肿瘤球形成率计算公式如下：肿瘤球形成率（100%）=每孔肿瘤球均数/接种活细胞总数（1000个细胞）×100%。

1.5 蛋白质印迹

加入 RIPA 细胞裂解液充分裂解细胞，获得细胞总提取物，BCA 法测定蛋白浓度。取等量蛋白，进行 12% SDS-PAGE 凝胶电泳分离样品；将蛋白电转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，封闭过夜，一抗 4℃孵育24 h，二抗室温温育2 h，化学发光法检测蛋白表达丰度。

1.6 统计学分析

实验数据录入Spss 15.0 for windows evaluation软件，建立数据库，各组实验数据均用均数±标准差（mean±SD）表示，用One Way ANOVA方式进行方差分析，两两比较采用t 检验进行统计。

2 结果

2.1 人肝细胞癌SMMC-7721细胞系原代和第2代球细胞肿瘤球形成率的比较

与人肝细胞癌SMMC-7721细胞相比，SMMC-7721细胞系第2代球形成细胞具较强自我更新能力（图1）。

2.2 人肝细胞癌SMMC-7721细胞系球细胞与亲本细胞CK2α蛋白表达的比较

人肝细胞癌SMMC-7721细胞系第2代球细胞高水平表达CK2α蛋白（图2）。

图1 人肝细胞癌SMMC-7721细胞系原代与第2代球细胞肿瘤球形成率的比较PCs：人肝细胞癌SMMC-7721细胞系细胞。SFCs：人肝细胞癌SMMC-7721细胞系第2代球细胞。SFCs与PCs相比：*P＜0.05。

图2 人肝细胞癌SMMC-7721细胞系球形成细胞高表达CK2α蛋白PCs：人肝细胞癌SMMC-7721细胞系细胞。SFCs：人肝细胞癌SMMC-7721细胞系第2代球细胞。

2.3 芹菜素对SMMC-7721细胞系肝癌干样细胞自我更新的影响

不同浓度芹菜素（终浓度为5、10、20 μmol/L）显著降低人肝细胞癌SMMC-7721细胞系第2代球细胞的肿瘤球形成率（图3）。

图3 芹菜素降低肝细胞癌SMMC-7721细胞系球细胞的肿瘤球形成率芹菜素（apigenin，5.0、10.0和20.0 μmol/L）处理组与溶媒（0.1% DMSO）对照组比较：*P＜0.05。芹菜素（apigenin，10.0和20.0 μmol/L）处理组与5.0 μmol/L apigenin处理组比较：#P＜0.05。数据表示3次独立实验的均数±标准差（Mean±SD，n=3）。

2.4 芹菜素对人肝细胞癌SMMC-7721细胞系肝癌干样细胞CK2α蛋白表达的影响

不同浓度芹菜素（终浓度为5、10、20μmol/L）显著降低人肝细胞癌SMMC-7721细胞系第2代球细胞CK2α蛋白表达水平（图4）。

图4 芹菜素降低肝细胞癌SMMC-7721细胞系肝癌干样细胞CK2α蛋白表达水平与溶媒（0.1% DMSO）对照组比较：*P＜0.05。与5.0 μmol/L apigenin处理组比较：#P＜0.05。数据表示3次独立实验的均数±标准差（Mean±SD，n=3）。

3 讨论

肿瘤干细胞理论认为肿瘤组织中存在化疗抵抗的干细胞样细胞群，在肝细胞癌中，肝癌干细胞能在化疗后重新构建肿瘤［6］。人肝细胞癌SMMC-7721细胞系是肝癌转移相关基因、蛋白研究及寻找特异性干预治疗靶点的良好模型之一，其生物学行为接近临床实际情况［7］。蛋白激酶 CK2 是一类真核细胞中普遍存在的丝/苏氨酸蛋白激酶，在细胞存活、生长、增殖及凋亡过程中具有重要的功能。在许多实体瘤如结肠癌、乳腺癌、肾癌、非小细胞肺癌和急、慢性髓性白血病细胞中，CK2 活性均增高［8］。Seldin D等［2］指出，酪氨酸激酶CK2可作为靶向胶质瘤和肿瘤干细胞的有希望的靶标。

本论文通过体外培养人肝癌SMMC-7721细胞系细胞，采用干细胞培养基超低粘附培养板悬浮培养法扩增球细胞，用Western blot对照检测人肝细胞癌SMMC-7721细胞系第2代球细胞与亲本细胞CK2α蛋白表达水平，结果证实：与人肝细胞癌SMMC-7721细胞相比。SMMC-7721细胞系第2代球细胞肿瘤球形成率和CK2α蛋白表达水平均显著增高。提示人肝细胞癌SMMC-7721细胞系第2代球细胞CK2激酶组成性活化，具有更强自我更新能力，可用作肝癌干样细胞模型。更有意义的是，我们的实验结果证明，芹菜素具有下调CK2α表达和抑制肝癌干样细胞自我更新作用。这些结果为评价芹菜素作为靶向干预肝癌干细胞样细胞，抑制肝细胞癌细胞自我更新特性，发挥治疗人肝细胞癌作用候选药物的价值提供有力的实验依据。

［1］ 魏小华, 梁杰. 蛋白激酶 CK2在肿瘤生物学中的作用［J］. 医学综述, 2011, 17(1) 75-77.

［2］ Seldin D, Landesman-Bollag E, Farago M, et al. CK2 as a positive regulator of Wnt signaling and tumorigenesis［J］ . Mol Cell Bio- chem, 2005, 274(1 /2)： 63-67.

［3］ Tang AQ, Cao XC, Tian L, et al. Apigenin inhibits the self-renewal capacity of human ovarian cancer SKOV3-derived sphere-forming cells［J］. Mol Med Rep.2015, 11(3)： 2221-2226.

［4］ Liu J, Cao XC, Xiao Q, et al. Apigenin inhibits HeLa sphere-forming cells through inactivation of casein kinase 2α［J］. Mol Med Rep, 2015, 11(1)： 665-669.

［5］ Zhang S, Wang Y, Mao JH, et al. Inhibition of CK2α down-regulates Hedgehog/Gli signaling leading to a reduction of a stem-like side population in human lung cancer cells［J］. PLoS One.2012, 7(6)： e38996.

［6］ Siegel R, DeSantis C, Virgo K, et al. Cancer treatment and survivorship statistics［J］, 2012. CA Cancer J Clin.2012, 62(4)： 220-241.

［7］ Begum N, Prasad NR, Kanimozhi G, et al. Apigenin ameliorates gamma radiation-induced cytogenetic alterations in cultured human bloodlymphocytes［J］. Mutat Res, 2012, 747(1)： 71-76.

［8］ Lau EY, Ho NP, Lee TK. Cancer Stem Cells and Their Microenvironment： Biology and Therapeutic Implications［J］. Stem Cells Int, 2017; 2017： 3714190.

Effects of apigenin on self-renewal and expression of CK2α of liver cancer stem-like cells derived from SMMC-7721 cell line

Jiang Su-fang, Xu Chang, Chen A, Cui Ying-hong, Li Xiang, Cao Jian-guo
(Pharmaceutical Science, Medical College, Hunan Normal University, Changsha 410013, China)

ObjectiveTo investigate whether or not apigenin inhibits self-renewal and down-regulates of CK2α expression of liver cancer stem-like cells (LCSLCs) from SMMC-7721 cell line.MethodsSpheres derived fromhuman hepatocellular carcinoma SMMC-7721 cell line was cultured and amplified by suspension culture in ultra-low adhesion plate using stem cellcondition medium refer to LCSLCs. Tumorsphere formation assay was used to determine self-renewal of LCSLCs. Western blot was used to analyze CK2α protein expression level.ResultsThe second generation spheres derived from SMMC-7721 cell line with intensive self-renewal potential take as LCSLCs. Apigenin significantly inhibited self-renewal capacity, and reduced the protein expression level of CK2 α of LCSLCs, in a concentration-dependent manner.ConclusionApigenin inhibited selfrenewal capacity of LCSLCs derived from SMMC-7721 cell line is associated with down-regulation of CK2 α expression.

apigenin; hepatocellular carcinoma; self renewal; CK2α

R735.7

A

1673-016X（2017）05-0001-03

2017-04-15

国家自然科学基金面上项目 (No.81172375); 长沙市科技局科技计划项目 (No. K1104060-31)

曹建国, E-mail:caojian2005@yahhao. com. cn