抗冻保护剂中蔗糖浓度决定卵母细胞脱除抗冻保护剂的方法

周艳华，范安然，黄文竹

（1．贵州医科大学 生物与工程学院；2.贵州医科大学 组织工程与干细胞实验中心，贵阳 贵州 550004）

抗冻保护剂中蔗糖浓度决定卵母细胞脱除抗冻保护剂的方法

周艳华1，范安然1，黄文竹2

（1．贵州医科大学 生物与工程学院；2.贵州医科大学 组织工程与干细胞实验中心，贵阳 贵州 550004）

本研究实验一采用三种添加不同浓度蔗糖的预处理液（S1，S2，S3）分别处理小鼠卵母细胞20mim，以PBS溶液或0.5mol/L蔗糖溶液脱除抗冻保护剂，统计卵母细胞的存活率.S1液为含10%v/v的PBS溶液；S2液在S1液的基础上蔗糖浓度添加至0.034mol/L；S3液在S1液的基础上蔗糖浓度添加至0.38mol/L.结果显示：以PBS液直接脱除抗冻保护剂，S1，S2，S3组卵母细胞的存活率分别为0，20%，54%.以0.5mol/L的蔗糖溶液脱除抗冻保护剂，S1，S2，S3组卵母细胞存活率分别为43%，50%，75%.实验二所有卵母细胞以 S1液预处理 3min，然后分别以 ES1，ES2，ES3液处理 30s，采用 PBS，0.25mol/L或 0.5 mol/L蔗糖溶液脱除抗冻保护剂.ES1液为40%v/v的EG溶液中添加了0.3mol/L的蔗糖；ES2液的蔗糖浓度为0.5mol/L；ES3液的蔗糖浓度为0.8mol/L.结果显示，随着蔗糖浓度的提高，卵母细胞以PBS脱除抗冻保护剂的存活率显著提高（ES3组57%vs ES1组3%）.该研究表明，预处理液或玻璃化液中添加蔗糖，均能影响卵母细胞脱除抗冻保护剂的方法.结论，在卵母细胞冷冻实验中，应根据冷冻液的成分设计相应的抗冻保护剂脱除方法.

卵母细胞；抗冻保护剂；蔗糖浓度；抗冻保护剂脱除

从1985年Rall等发明玻璃化冷冻以来[1]，该技术已在小鼠，牛，人等卵母细胞和胚胎冷冻上广泛应用.随着对玻璃化冷冻原理的研究，玻璃化液也有了较大的改进.其中的主要成分有渗透性抗冻保护剂和非渗透性抗冻保护剂.渗透性抗冻保护剂有二甲基亚砜，乙二醇，丙二醇，丙三醇等；非渗透性抗冻保护剂有聚蔗糖，聚乙二醇，聚乙烯吡咯烷酮，蔗糖等大分子物质.非渗透性抗冻保护剂中使用较多的是蔗糖，其不仅在冷冻液中有添加，在解冻液中也是非常必要的添加成分.解冻液中添加蔗糖的作用主要是利用蔗糖在细胞外产生较高的渗透压，防止解冻时水分过度渗入细胞造成细胞崩解；冷冻液中添加蔗糖一是增加溶液的粘稠度，有利于溶液玻璃化的形成；二是使细胞保持收缩的状态，防止抗冻保护剂过多的渗入细胞.在诸多的研究中，冷冻方法多种多样，解冻方法也多种多样.多数研究者分开来探讨抗冻保护剂的添加和脱除方案对卵母细胞存活率的影响.作者认为，抗冻保护剂的添加程序决定了其脱除程序.当抗冻保护剂中含有不同浓度的蔗糖时，溶液的渗透压不同，进而影响细胞的收缩程度，影响抗冻保护剂渗入胞内的量.所以本研究设计了两个实验，分别在预处理液和玻璃化液中添加不同浓度的蔗糖，比较了蔗糖浓度对卵母细胞脱除抗冻保护剂后存活率的影响.由于抗冻保护剂具有一定的毒性，所以脱除抗冻保护剂又称为脱毒.

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

小鼠卵母细胞的获取：选择4—6周龄雌性昆明白小鼠，腹腔注射PMSG（宁波激素厂生产）10U/只，48h后腹腔注射hCG（宁波激素厂生产）10U/只，14h后颈椎脱臼处死小鼠，暴露腹腔剪取输卵管.用剥卵针剥开输卵管壶腹部，收取卵丘卵母细胞复合体，采用0.03%透明质酸酶37℃消化2min，将脱去卵丘颗粒细胞的卵母细胞收集到PBS（Gibco，2012050）溶液中待用.

1.2 预处理液和玻璃化液的配制

预处理液和玻璃化液均以PBS液为基础液，在其中加入不同浓度的乙二醇（EG）和蔗糖（sucrose）.

?

1.3 实验方法

实验一，选择排出第一极体形状规则的卵母细胞随机分为6组，每组10枚，各组卵母细胞分别用S1，S2或S3液处理20min，然后分别用PBS或0.5mol/L的蔗糖溶液脱毒，统计各组脱除抗冻保护剂后卵母细胞存活率，实验重复3次.

实验二，卵母细胞随机分为9组，每组卵母细胞经S1液预处理 3min，分别以 ES1，ES2或 ES3液处理 30s，以PBS，0.25mol/L或0.50mol/L的蔗糖溶液脱毒，统计卵母细胞存活率，实验重复3次.

使用spss统计软件（spss18）对卵母细胞存活率进行ANOVA单因素方差分析和Duncan’s检验方法判断不同处理组之间的差异显著性，P＜0.05时即认为差异显著.

2 结果

2.1 预处理液中添加不同浓度蔗糖对卵母细胞脱毒后存活率的影响

注：同一列上标不同字母表示差异显著（P＜0.05）.

2.2 玻璃化液中添加不同浓度蔗糖对卵母细胞脱毒后存活率的影响

注：同一列上标不同字母表示差异显著（P＜0.05）.

3 讨论

本实验所用到的S1液为含10%v/v EG的PBS溶液，是玻璃化冷冻中常用的预处理液，有研究表明，在该溶液中达到平衡时小鼠卵母细胞体积是初始体积的1.1倍[2].S2液是在S1液的基础上添加了一定量的蔗糖，该浓度下达到平衡时卵母细胞体积等于初始体积；S3液在S1液的基础上将蔗糖浓度提高至0.38mol/L，该浓度下达到平衡时卵母细胞体积约为初始体积的1/2.为了减少聚蔗糖（Ficoll）的干扰，ES1，ES2，ES3 液除未添加聚蔗糖（Ficoll）外，其组成与其他研究者常用的玻璃化液相同[3].Wang等采用EG作为抗冻保护剂，认为4步添加法结合2步脱除法可以降低牛卵母细胞经受的渗透压损伤，与1步添加和1步脱除方法相比获得了较高的存活率和囊胚率[4].Kobayashi等玻璃化冷冻猪胚胎，对2步法脱毒和1步法脱毒进行比较，结果表明2步法脱毒后可以获得85%的胚胎存活率，而1步脱毒组仅有40%的存活率[5].这些研究多数认为分步脱毒法可以降低细胞脱毒时的渗透压损伤，从而获得较高的存活率.事实上，抗冻保护剂的脱除程序与抗冻保护剂的添加程序是密切相关的，针对特定的抗冻保护剂添加过程应该采取对应的脱毒步骤[6].实际应用中遵循“越简单越实用”的原则.抗冻保护剂的脱除过程越简单，越易于实际操作.脱毒时需要多高浓度的蔗糖取决于抗冻保护剂添加过程中有多少抗冻保护剂渗入到胞内.冷冻液中添加蔗糖可以增加玻璃化液的粘稠度，有利于玻璃化的形成；同时蔗糖可以使细胞收缩，减少抗冻保护剂过度渗入胞内.但是抗冻保护剂中添加过高浓度的蔗糖会占据溶液较大的体积，导致溶液中渗透性抗冻保护剂的相对浓度升高，增加溶液毒性.本实验室前期实验表明，玻璃化液中添加0.8mol/L的蔗糖相对于0.5mol/L蔗糖添加组，牛囊胚冷冻存活率显著降低，19%vs83%（数据未发表）.本实验中，在设计的蔗糖浓度范围内，随着蔗糖浓度的增加，以PBS或蔗糖溶液脱毒后卵母细胞存活率均有所升高.理想情况下，最简单的脱毒方法是采用PBS直接脱毒.通过本实验证明，抗冻保护剂中添加一定浓度的蔗糖可以降低卵母细胞脱毒时的渗透压损伤，增加卵母细胞存活率，预示采用PBS直接脱毒的解冻方法具有可行性.

〔1〕Rall,W.F.and G.M.Fahy,Ice-free cryopreservation of mouse embryos at-196 C by vitrification.1985.

〔2〕Pedro P B,Yokoyama E,Zhu S E,et al.Permeability of mouse oocytes and embryos at various developmental stages to five cryoprotectants[J].Journal of Reproduction&Development,2005,51(2):235.

〔3〕Jin B,Mochida K,Ogura A,et al.Equilibrium vitrification of mouse embryos at various developmental stages[J].Molecular Reproduction&Development,2012,79(11):785–794.

〔4〕Wang,X.,Al Naib,A.,Sun,DW.,et al.,Membrane permeability characteristics of bovine oocytes and development of a step-wise cryoprotectant adding and diluting protocol.Cryobiology,2010.61(1):58-65.

R714；S814.48

A

1673-260X（2017）10-0081-02

2017-07-12

贵州省科技计划项目(2017-16)

黄文竹（1983-），女，博士，讲师，贵州医科大学，研究方向：生物信息学，E-mail：2008elite@163．com