对食品中脱氢乙酸HPLC检验方法的研究

于喆源（张掖市食品药品检验检测中心，甘肃 张掖 734000）张婕（兰州市食品药品检验所，甘肃 兰州 730000）

对食品中脱氢乙酸HPLC检验方法的研究

于喆源（张掖市食品药品检验检测中心，甘肃 张掖 734000）张婕（兰州市食品药品检验所，甘肃 兰州 730000）

在脱氢乙酸的高效液相法检测时，常会因为保留时间漂移和峰形拖尾严重，影响对目标物的定性和定量。本文通过对脱氢乙酸化学性质的分析及考察样品pH，流动相pH，色谱柱类型对检测的影响，来有效控制拖尾和保留时间漂移，提高检测准确性。研究结果表明：用HPLC检验脱氢乙酸，采用封尾工艺的色谱柱，样品pH在5-7，流动相用pH=4.5的醋酸钠缓冲液-甲醇（85:15）体系检验，回收率，精密度，检出限，重现性良好，能更好的满足样品检验的需求。

高效液相色谱；pH值；脱氢乙酸

脱氢乙酸钠是一种广谱，抑菌力极强的食品防腐剂。对霉菌、酵母菌、细菌的抑制能力特别强，广泛的应用于果汁、酱菜、乳酸菌饮料、果酱、糕点等各类食品加工行业中[1]。在我国为合法添加剂，最大限制为0.3g/kg[2]。

目前脱氢乙酸的检测国标方法为气相色谱法和高效液相色谱法。气相色谱法实验流程较为繁琐，目前大部分实验室选择使用液相色谱法进行检测分析。依据国标方法，采用C18色谱柱，乙酸铵缓冲盐溶液-甲醇（90:10）体系为流动相时，经常出现保留时间漂移和严重的峰形拖尾现象，增加实验的不确定性[3-6]。为此本文通过对脱氢乙酸化学性质的分析，研究色谱柱工艺和样品pH，流动相pH对分析的影响，提出改进方法，尽可能达到在稳定色谱条件分析目标物的目的。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪：安捷伦1260型，配有二极管阵列检测器；梅特勒万分之一天平：EL204-IC；梅特勒千分之一天平：ML503/02；离心机：10000r/min，tgl-16a高速离心机，长沙平凡仪器仪表有限公司；酸度计：梅特勒320型；甲醇：色谱纯，德国默克；脱氢乙酸标准品：纯度≥99.5%，美国sigma公司；其他试剂均为优级纯；实验用水为满足GB/T 6682的一级水。

1.2 标准溶液的配置

脱氢乙酸储备液（1.0mg/ml）:精密称取脱氢乙酸标准品100mg至100ml容量瓶，用20ml氢氧化钠溶液（20g/L）溶解后用水定容。4℃保存。

脱氢乙酸标准曲线工作液：分别吸取0.1、0.5、1.0、5.0、10、20ml的脱氢乙酸储备液，用水定容至100ml容量瓶中。制成浓度为1.00、5.00、10.0、50.0、100、200ug/ml的标准曲线工作液。4℃保存。

1.3 样品处理

称取样品1g（液体样品吸取1g）至50ml离心管中，精密加水15ml，超声处理30min，然后分别精密加入亚铁氰化钾溶液和乙酸锌溶液各2.5ml，振摇，8000r/min离心10min，取上清液，分别用乙酸和氢氧化钠溶液调节pH为5、7，9，过0.45um滤膜后上机。

1.4 色谱条件

第一组C18未封尾+乙酸铵（0.02mol/L）缓冲液-甲醇（90:10）体系流动相[7]

第二组C18封尾柱+乙酸铵（0.02mol/L）缓冲液-甲醇（90:10）体系流动相

第三组C18封尾柱+乙酸铵（0.02mol/L，后用乙酸调节pH为5.5）缓冲液-甲醇（90:10）体系流动相

第四组C18封尾柱+乙酸钠（pH=4.5）缓冲液-甲醇（90:10）体系流动相

封尾柱为：Agilent Extend-C18(250mm*4.6mm,5um)

非封尾柱为：Agilent SB-C18(250mm*4.6mm,5um)

检测器波长:293nm，进样量:10ul，流速1ml/min，保留时间定性，峰面积定量。

2 结果与分析

2.1 样品pH对检验的影响

依据上述样品处理方法，调节pH后，国标色谱条件（第一组）进样，考察其保留时间，峰形对称性。

在碱性环境下，脱氢乙酸会得到裂峰，不能作为定量定性依据，故拖尾因子未标出。国标GB 5009.121-2016要求对样品提取液要调节pH值至中性或酸性，但多数糕点会使用纯碱等碱性物质，所以碱性较强，不利于分析。综上，确定样品pH为7为最佳。

2.3 流动相pH对检测的影响

表1是样品pH为7，采用封尾工艺色谱柱时，不同pH流动相对其峰形和保留时间的影响。

表1

由表可知，流动相pH对于脱氢乙酸的保留时间无明显影响，但对其峰形对称性有较为明显的影响。在使用中性体系流动相时峰形对称性差，随着流动相酸性的增加，峰形对称性好转，当pH达到4.5时，峰形对称性已到达1.01。综上，乙酸钠（pH=4.5）缓冲液-甲醇体系流动相更适合脱氢乙酸分析。

2.4 标准曲线线性，精密度和最低检出限

使用1.2配置的标准曲线工作液，在上述实验中得到的最佳条件进样，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到回归方程y=22.43799x-17.15686，r=0.9998，线性良好。6针连续进样，RSD小于0.7%，精密度良好。在该条件下，以3倍信噪比为检出限，以10倍信噪比为定量限，检测线达到0.2mg/kg，定量限达到2mg/kg，满足国标GB 5009.121-2016对检出限，定量限的规定。

3 结语

通过对脱氢乙酸化学性质的分析和实验证明，在脱氢乙酸的分析中，采用封尾色谱柱和偏酸性流动相可以更好的得到稳定的结果。当流动相构成为乙酸钠缓冲液（pH=4.5）-甲醇体系时，调整两相比例，对峰形和稳定性影响不显著，选择85：15的比例作为实验比例，可以在保证稳定的情况下，有效提高实验效率，减少工作负荷。

[1]骆萌.脱氢乙酸及相关化合物生产技术[J].化工中间体,2004,7(1):31-33.

[2]明立艳,张忠义.高效液相色谱法测定食品中脱氢乙酸含量[J].食品研究与开发,2009,30(3):106-108.

[3]GB/T 23377—2009,食品中脱氢乙酸的测定高效液相色谱法[S].中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局,2009.

[4]王若燕,王立媛.高效液相色谱法测定食品中脱氢乙酸含量的研究[J].浙江科学学院学报,2003,15(11):97-99.

[5]张辉珍,马爱国,梁惠,等.高效液相色谱法测定食品中脱氢乙酸的方法研究[J].卫生研究,2007,36(6):748-750.

[6]GB 5009.121-2016食品安全国家标准[S]食品中脱氢乙酸的测定.