淋巴细胞主动免疫治疗对封闭抗体阴性复发性流产后患者外周血Th1/Th2/Th17细胞因子表达水平变化

史晓艳，陈 铭，石玉玲

1.陕西省榆林市儿童医院检验科(榆林 719000)，2.陕西省榆林市中心血站(榆林 719000)

△通讯作者

淋巴细胞主动免疫治疗对封闭抗体阴性复发性流产后患者外周血Th1/Th2/Th17细胞因子表达水平变化

史晓艳1，陈 铭2△，石玉玲1

1.陕西省榆林市儿童医院检验科(榆林 719000)，2.陕西省榆林市中心血站(榆林 719000)

目的：研究封闭抗体阴性复发性流产患者发病机制及复发性流产患者外周血中Th1/Th2/Th17细胞因子水平变化，探讨其在复发性流产发病机制中的作用及淋巴细胞主动免疫治疗复发性流产患者分子机制。 方法：选取封闭抗体阴性复发性流产患者50例作为治疗组，既往无不良妊娠史，至少一胎正常分娩史的健康育龄女性44例作为对照组。采用酶联免疫法(ELISA)检测复发性流产患者的封闭抗体，比较封闭抗体阴性与阳性复发性流产患者妊娠结局差异性；采用ELISA检测对照组、治疗组治疗前及治疗后外周血中Th1/Th2/Th17细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-17、IL-4、IL-10含量，并比较对照组与治疗组，治疗组治疗前后外周血中Th1/Th2/Th17细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-17、IL-4、IL-10含量的差异性。结论：主动免疫疗法可下调RSA患者Th1/Th17细胞因子IL-2、IL-17表达水平，上调Th2细胞因子IL-4表达水平，使Th1/Th2/Th17处于平衡模式；同时刺激免疫应答，产生封闭抗体，二者协同调节Th1/Th2/Th17细胞平衡，增强RSA患者免疫耐受作用，为正常妊娠提供适宜的内环境，从而提高妊娠成功率。

复发性流产(Recurrent spontaneous abortion，RSA)是指与同一配偶连续发生3次或3次以上的自然流产，其中40%～60%的RSA患者病因与免疫有关，免疫因素中缺乏封闭抗体的RSA患者约占66.67%[1]。目前，临床上针对缺乏封闭抗体的RSA患者，主要采用淋巴细胞主动免疫(Lymphocyte immunization therapy，LIT)疗法提高 RSA患者妊娠成功率。既往研究RSA发病机制着重点置于Th1/Th2细胞平衡上，认为Th1/Th2细胞平衡为正常妊娠提供适宜的免疫环境，然而近年发现Th17细胞亚群解释了许多Th1/Th2细胞失衡并不能完全解释的免疫耐受机制，Th1/Th2/Th17细胞及其细胞因子之间相互调节，形成精湛而复杂的免疫调控网络，在维持机体内环境稳定过程中具有一定的作用。本研究分析健康育龄妇女与封闭抗体阴性复发性流产患者外周血Th1/Th2/Th17细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17表达水平差异性；以及主动免疫疗法治疗RSA患者治疗前后外周血中IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17细胞因子表达水平差异，现报告如下。

资料与方法

1 一般资料 选自2014年5月至2016年5月就诊于我院的RSA患者50例作为治疗组，以及同期体检、既往无不良妊娠史，至少一胎正常分娩史的健康育龄女性44例作为对照组。研究对象均已签署知情同意书。治疗组与对照组平均年龄分别为(30.06±3.41)岁、(29.73±3.07)岁，平均BMI分别为(21.06±2.60)kg/m2，(21.28±2.11)kg/m2。纳入标准：治疗组自然流产2次及以上，封闭抗体阴性，无子宫畸形、多囊卵巢综合征等解剖结构异常因素，内分泌功能无异常，无HPV、衣原体、支原体、巨细胞病毒、弓形虫、梅毒等病原体感染生殖道，抗心磷脂抗体、抗核抗体等自身抗体均阴性，凝血功能无异常等，丈夫精液活动度、数量、活性等质量正常、无畸形，无性功能障碍、感染性疾病，夫妻双方染色体无异常；对照组身体健康，既往无不良妊娠史的育龄女性。

2 主动免疫治疗 碘伏消毒后，采集患者丈夫或者第三者肘静脉血至肝素抗凝管，每管5 ml，共30 ml；然后放置37 ℃温箱3 h使血细胞自然沉降，形成分层；将血液标本放置无菌操作台，在无菌环境下，吸取血浆至含5ml的磷酸氢二钠缓冲液的15 ml离心管；将稀释的血浆缓慢加至2个分别含5 ml淋巴分离液的15ml离心管中，4000 r/min，15 min；使用3 ml的无菌吸管吸取分层液界面处淋巴细胞层至一个15 ml离心管内，3000 r/min，5 min；弃上清，5 ml磷酸氢二钠缓冲液洗涤管底淋巴细胞两次；利用0.9% NaCl 溶液将其制成淋巴细胞悬液，并将其稀释为(20～40)×106/ml，吸取1ml淋巴细胞悬液，分6个点注射于患者前臂内侧皮下，然后观察患者30 min方可。

3 标本收集 采集主动免疫治疗前、治疗后RSA患者及对照组外周血各4 ml至促凝管，3000 r/min，离心10 min，取上清，并将其分装至5个1.5 ml EP管中，冻存在-20 ℃，待检测样本时取出，避免反复冻融；避免使用溶血、高血脂或污染标本。

4 主要试剂与仪器 HLA特异性IgG抗体检测试剂盒(美国One Lambda公司)、人外周血淋巴细胞分离液(天津市灏洋生物)、IL-2 ELISA试剂盒(达科为生物)、IFN-γ、IL-4 ELISA试剂盒(厦门慧嘉)、IL-10、IL-17 ELISA试剂盒(北京博凌科为生物)、离心机(KUBOTA，日本)、恒温培养箱(上海智城)、酶标仪(Bio-Tek ELx800NB，美国伯腾)、酶标洗板机(上海永创)、超净工作台(B)等。

5 检测方法 封闭抗体、IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17细胞因子检测均采用ELISA法检测，操作严格按照说明书进行并保证在试剂有效期内使用，且保证质控符合国家规定。

6 妊娠结局判定 妊娠成功：妊娠12周后，B超结果提示宫内活胎，否则为妊娠失败。

结 果

1 RSA患者经主动免疫治疗后封闭抗体转阳情况与妊娠结局 对照组50例封闭抗体均为阴性，经过3次主动免疫疗法治疗结束后，35例患者封闭抗体阳性，阳性率70%。44例复发性流程患者妊娠，35例妊娠成功，妊娠成功率79.55%。在44例妊娠对象中，30例封闭抗体阳性患者中妊娠成功27例，妊娠成功率90.0%；14例封闭抗体阴性患者中成功妊娠8例，妊娠成功率为57.14%。封闭抗体阳性与阴性患者之间的妊娠成功率比较差异有统计学意义，可认为封闭抗体阳性的RSA患者妊娠成功率高于封闭抗体阴性患者，见表1。

表1 封闭抗体阳性与阴性RSA患者之间妊娠成功率比较(例)

2 对照组与治疗组主动免疫疗法治疗前外周血中Th1/Th2/Th17细胞因子表达水平比较 对照组中IL-4、IL-10表达水平显著高于治疗组治疗前(P<0.01)；而IFN-γ、IL-2、IL-17表达水平显著低于治疗组治疗前(P<0.01)，见表2。

3 治疗组中治疗前与治疗后外周血中Th1/Th2/Th17细胞因子表达水平比较 治疗组治疗后IL-4表达水平显著高于治疗前(P<0.01)，IL-2、IL-4、IL-17表达水平显著低于治疗前(P<0.05)；而治疗组治疗前、后IFN-γ、IL-10表达水平无统计学差异，见表3。

表2 对照组与治疗组主动免疫疗法治疗前外周血中Th1/Th2/Th17细胞因子水平比较(pg/ml)

表3 治疗组中主动免疫疗法治疗前与治疗后外周Th1/Th2/Th17细胞因子水平的比较(pg/ml)

讨 论

1 主动免疫疗法对妊娠结局的影响 截止目前，文献报道，主动免疫疗法治疗封闭抗体阴性的RSA疗效为70%～90%[2-3]。本次研究通过主动免疫疗法疗法对封闭抗体阴性RSA患者进行治疗，封闭抗体阳性率明显增加，治疗组中妊娠成功率明显提高，与相关文献报道相一致，提示通过主动免疫疗法治疗，刺激机体产生封闭抗体，以致母体形成免疫耐受，降低母体对胎儿的识别与反应能力，使胎儿免受母体免疫系统的攻击，从而提高妊娠成功率。

2 RSA患者Th1/Th2/Th17细胞因子水平变化情况 有报道显示，原因不明RSA患者中Th1/Th2免疫平衡紊乱，当Th1/Th2失调后，可称为“Th1或Th2偏移”，由Th1/Th2细胞平衡向Th2型漂移状态转变为向Th1型漂移，Th1比例增高；此时，Th1/Th2免疫平衡紊乱就会影响胚胎生长发育，严重时会引起流产[4]。Th17是CD4+T细胞近年发现的新亚群，Th17通过活化细胞、刺激细胞分泌细胞因子。生理水平的IL-17有利于胚胎着床、胎盘形成，可抑制滋养细胞凋亡；IL-17比例增高被认为对妊娠不利，当其表达过度时，可引起母体免疫排斥、炎症反应，导致胚胎流产[5]。文献报道，Th17细胞在RSA患者外周血及蜕膜中明显高于正常妊娠妇女[6-8]。本次研究显示，封闭抗体阴性的RSA患者外周血中IL-4、IL-10表达水平降低，而IFN-γ、IL-2、IL-17表达水平升高。提示封闭抗体患者外周血中Th1/Th2/Th17细胞平衡模式破坏，Th1、Th17细胞因子升高、Th2细胞因子降低时，可使胎盘受损，引发流产[9]。

3 淋巴细胞主动免疫疗法对Th1/Th2/Th17细胞因子水平变化的影响 研究显示，主动免疫疗法可提高Th2细胞因子比例，降低Th1、Th17细胞因子比例，并可提高原因不明的RSA患者妊娠成功率[10-11]。本研究发现经主动免疫疗法治疗后，RSA患者外周血中Th1、Th17细胞因子IL-2、IL-17显著降低，IFN-γ无明显变化；Th2型细胞因子IL-4显著升高，IL-10无明显变化。提示IL-2、IL-17、IL-4细胞因子可能参与RSA的发病机制，主动免疫疗法疗法可影响IL-2、IL-17 、IL-4 Th细胞型细胞因子的表达水平；推测主动免疫疗法对RSA患者中Th2细胞因子IL-4有上调作用，Th1、Th17细胞因子IL-2、IL-17有下调作用，使Th1/Th2/Th17处于平衡模式；同时刺激CD4+T细胞因子进行免疫应答，同时产生封闭抗体封闭抗体与主动免疫疗法协同调节Th1/Th2/Th17细胞平衡，增强免疫耐受作用，为正常妊娠提供适宜的内环境。

总之，通过本次研究发现RSA患者外周血中Th1、Th17细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-17浓度增高，Th2细胞因子IL-4、IL-10浓度减低；通过主动免疫治疗封闭抗体阴性的RSA患者，可刺激RSA患者产生封闭抗体，降低IL-2、IL-17水平，升高IL-4水平；提高患者妊娠成功率；推测对封闭抗体阴性RSA患者采用主动免疫疗法，可增加RSA患者中Th2细胞因子，降低Th1、Th17细胞因子，对Th1/Th2/Th17细胞因子处于动态平衡模式有促进作用；同时刺激CD4+T细胞因子进行免疫应答，产生封闭抗体，其与主动免疫疗法协同调节Th1/Th2/Th17细胞平衡，可保护正常妊娠的顺利进行。 据此，检测外周血中Th1/Th2/Th17细胞因子含量，操作方便，可行性强，可提示RSA患者机体免疫平衡状态，考虑作为评估主动免疫疗法疗效的指针，与检测封闭抗体联合起来，共同为RSA患者再次妊娠时机提供依据。

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(收稿：2017-05-23)

淋巴细胞 免疫，主动 抗体，封闭 流产，自然 细胞因子类

R737.31

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.10.036