高效液相色谱法测定白酒中纽甜含量影响因素的探究

刘石雪，唐丽云

（沂蒙老区酒业有限公司，山东临沂276700）

高效液相色谱法测定白酒中纽甜含量影响因素的探究

刘石雪，唐丽云

（沂蒙老区酒业有限公司，山东临沂276700）

本实验对高效液相色谱法测定白酒中纽甜含量的各个影响因素进行了探究，优化了实验条件。采用Agilent C18色谱柱(5 μm,150 mm×4.6 mm),流动相为乙腈-离子对试剂缓冲液，紫外检测器波长210 nm，柱温30℃，流速1 mL/min。结果表明，纽甜浓度在0.16～25 μg/mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，检出限0.06 μg/mL，加标回收率在93.75%～98.13%之间。该方法分离度较好，操作稳定，数据准确,适用于白酒中纽甜的检测。

高效液相色谱法； 纽甜； 白酒

纽甜是一种新一代的人工合成的二肽类强力甜味剂，其化学名称为N-［N-(3,3-二甲基丁基)-L-α-天门冬氨酰］-L-苯丙氨酸-1-甲酯，分子式为C20H30N2O5[1-2]。由于具有高甜度、无龋齿性、高安全性、高稳定性、协同增效性、适用范围广、添加方式多样等优点，可以替代蔗糖、阿斯巴甜等甜味剂，并广泛添加到食品中[3]。例如可以添加到乳制品、谷物食品、糖果、巧克力、钙片、饮料、烘焙食品、复合调味料等食品中。其热值小、不参与人体代谢过程，适当的添加量可以起到改善口感的作用，不会引起人的肥胖、高血压、糖尿病等疾病[4]，因此是一种无营养安全类食品添加剂。但依据国家强制性标准GB 2760—2014食品添加剂使用标准，纽甜不在白酒(食品分类号15.01.01)允许使用的范围之内，即发酵酒种中不得添加甜味剂[5-6]。

最新食品安全国家标准GB 5009.247—2016规定了食品中纽甜测定的高效液相色谱法[7]，其前处理过程包括混合提取液提取、固相萃取柱净化、氮吹浓缩等步骤，处理过程较为复杂，影响因素较多。因此本实验在国标法基础上对白酒中纽甜提取的过程、液相色谱条件等关键控制点进行实验探究，为以后测定白酒中纽甜的含量提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

酒样：市售白酒样。

试剂：乙腈（色谱纯，德国默克股份两合公司）；甲醇（色谱纯，德国默克股份两合公司）；甲酸（色谱纯，科密欧）；三乙胺（色谱纯，科密欧）；磷酸（分析纯，科密欧）；辛烷磺酸钠（色谱纯，科密欧）；纽甜标准溶液（纯度≥99.0%）。

仪器设备：高效液相色谱仪（Agilent1260II型，配有紫外检测器）；超声波清洗仪（朗博仪器制造有限公司）；分析天平（梅特勒·托利多AL104型）；漩涡振荡器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；DN系列氮吹仪（天津市东康科技有限公司）；HSE系列固相萃取装置（天津市恒奥科技发展有限公司）。

1.2 仪器条件

色谱柱：C18色谱柱，5 μm，150 mm×4.6 mm（内径）；柱温30℃；流速1.0 mL/min；检测波长210 nm，进样量50 μL；流动相A乙腈、B离子对试剂缓冲液。梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序

1.3 标准溶液制备

标准储备液：准确称取0.1000 g纽甜标准品，加混合提取液溶解定容至100 mL，此溶液纽甜含量为1.00 mg/mL。

标准工作液：稀释标准储备液至浓度分别为0.16 μg/mL、0.80 μg/mL、1.60 μg/mL、4.00 μg/mL、8.00 μg/mL、25.00 μg/mL等系列标准工作液。

1.4 样品前处理

准确量取10.0 mL试样于50 mL具塞塑料离心管中，加入30 mL混合提取液，振荡混匀。超声15 min后，用混合提取液定容至刻度。吸取10.0 mL溶液以2 mL/min的流速通过固相萃取柱；待滤液完全流出后，用5 mL混合提取液以2 mL/min的流速淋洗萃取柱，弃去全部流出液；最后用5 mL甲醇以1 mL/min的流速洗脱。洗脱液在40℃水浴中用氮吹仪浓缩，混合提取液定容至2.0 mL，经0.45 μm滤膜过滤后作为待测液供色谱分析[7]。

2 结果与分析

2.1 前处理方法的影响

前处理方法的影响对同一个酒样进行了3组实验：第1组，根据1.4所述处理过程进行酒样前处理，后用氮吹仪浓缩近干，混合提取液定容至2.0 mL。第2组，根据1.4所述处理过程进行酒样前处理，后用氮吹仪浓缩至1.0 mL，混合提取液定容至2.0 mL。第3组，样品不经过前处理，直接加热除去乙醇，用水定容至2.0 mL。结果显示：第1组、第2组，纽甜分离度好，杂峰较少，回收率较高，并且氮吹浓缩的体积对结果定量影响不大，纽甜含量均为0.39 μg/mL。第3组，纽甜分离度不好，杂峰较多，回收率低，纽甜含量为0.08 μg/mL。结果见图1。

2.2 检测波长的选择

纽甜在206 nm波长到218 nm波长间都有吸收峰[9-10]，但是考虑到乙腈在210 nm以下也有较强的吸收峰。因此选择波长218 nm、212 nm、210 nm进行实验，结果见图2。从图2可看出，波长210 nm时，样品中纽甜吸收峰最高，最为灵敏。因此选择210 nm为实验波长。

2.3 色谱柱温度的影响

选取不同柱温25℃、28℃、30℃、32℃、35℃进行实验，结果表明，色谱柱温度对纽甜的保留时间和色谱峰形影响不大。考虑到温度过低或者过高不易控制，并且受环境影响较大，确定本实验的检测柱温为30℃。

2.4 流动相变化的影响

对乙腈和离子对试剂缓冲液梯度洗脱程序进行优化，结果表明表1梯度洗脱程序具有较好分离效果，能满足检测要求。

图1 前处理方法对酒样中纽甜含量的影响

图2 检测波长对酒样中纽甜含量的影响

2.5 流速变化的影响

流动相流速的高低影响色谱柱的柱效、系统的压力、各个组分分离效果和保留时间。选择实验的流速为0.6 mL/min、0.8 mL/min、1.0 mL/min、1.2 mL/min，结果表明，随着流速增大，各组分出峰时间提前，在0.8 mL/min、1.0 mL/min时，出峰时间合适，分离度较好。因此确定本实验流速为1.0 mL/min。

2.6 在优化条件下进行纽甜测定实验

2.6.1 标准曲线和线性范围

分别取0.16 μg/mL、0.80 μg/mL、1.60 μg/mL、4.00 μg/mL、8.00 μg/mL、25.00 μg/mL 的系列纽甜标准溶液，以峰面积为纵坐标，以标液浓度为横坐标作线性回归，得到如下回归方程：y=25.879x+0.714，r=0.9999。可见，纽甜在浓度0.16～25.0 µg/mL浓度范围内，线性关系良好（图3）。

图3 纽甜的标准曲线

2.6.2 检出限的确定

根据GB/T 5009.1—2003《食品卫生检验方法理化部分总则》[8]中对检出限的规定，把3倍空白值的标准偏差相对应的质量或浓度称为检出限。色谱法（GC,HPLC）的检出限为色谱仪最低响应值（仪器噪音水平的3倍）/标准曲线回归方程斜率。平均测定20次，得出本实验纽甜检出限为0.06 μg/mL。

2.6.3 样品加标回收率和精密度实验

选取不含纽甜的空白酒样，根据实验要求分别加入一定量纽甜标液，使其浓度分别为0.4 μg/mL、0.8 μg/mL、1.6 μg/mL、3.2 μg/mL、6.4 μg/mL，每个浓度做3次平行试样。根据上述方法进行前处理，测定其纽甜含量。按外标法进行定量，并计算其加标回收率，具体情况见表2。由表2可以看出，此方法的加标回收率在93.75%～98.13%之间，相对标准偏差1.82%，测定结果准确。

2.6.4 样品检测结果

表2 加标回收实验

从市场上抽取4个酒样，按上述优化后的处理方法进行纽甜检测，每个样品做3个平行实验。结果表明，1#、2#样品未检出，3#样品为0.33 mg/L，RSD为1.0%。检测结果见图4。

图4 标样及3#样品检测结果

3 结论

根据本实验室的仪器设备和色谱柱性能，对GB 5009.247—2016规定的食品中纽甜测定的高效液相色谱法[7]进行优化改进。确定了新的乙腈、离子对试剂缓冲液的洗脱梯度、210 nm的检测波长，获得了更加准确的分离度和响应值。并对前处理过程的关键控制点进行把控实验，确定对实验数据准确性的影响，为以后其他企业和检测机构纽甜实验检测数据的准确性提供参考依据。

[1]鲁琳,杭义萍,高燕红.高效液相色谱法快速检测乳饮料中常用甜味剂[J].食品科学,2009,30(10)：166-168.

[2]郑鹏然,周树南.食品卫生全书[M].北京：红旗出版社,1996：642-643.

[3]魏志勇,刘颖秋,佘志刚.纽甜的应用及研究进展[J].食品工业科技,2008(12)：252-254.

[4]刘家常,张露新,李欣.食品甜味剂及其检测技术[J].口岸卫生控制,2011,16(4)：16-19.

[5]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准食品添加剂使用标准：GB 2760—2014[S].北京：中国标准出版社,2015.

[6]张莹,远辉,丁春瑞.超高效液相色谱法测定白酒中纽甜不确定度评定[J].酿酒科技,2016(12)：99-103.

[7]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准食品中纽甜的测定：GB 5009.247—2016[S].北京：中国标准出版社,2017.

[8]中华人民共和国国家卫生部.食品卫生检验方法理化部分总则：GB/T 5009.1—2003[S].北京：中国标准出版社,2004.

[9]张晖,薛洪宝,杨俊松,等.HPLC测定食品中甜味剂的含量[J].光谱实验室,2013,30(4)：1813-1817.

[10]曹峰,许霞.高效液相色谱法测定莱芜姜酒中的纽甜含量[J].食品科学技术学报,2014,32(6)：77-80.

茅台集团“匠中匠”酒博会签约3亿元

本刊讯：据《贵州日报》报道，2017年9月8日,贵州茅台集团白金酒公司高端酱酒“匠中匠”品牌发布会在贵阳中天凯悦酒店举行。中国酒类流通协会副秘书长、中国酒业论坛创始人赵禹,酒仙网董事长郝鸿峰,贵州省白酒产业顾问权图,贵州省烟草学会秘书长毛学军等行业嘉宾前来祝贺。

发布会上,匠中匠CEO董兵勾勒了“匠中匠”的未来规划,提出要在3年内,将匠中匠打造成10亿元规模的品牌,成为贵州茅台集团白金酒公司旗下又一款超级大单品,成为茅台品牌家族的又一颗明星!近200名来自贵州本地和华东、华中、华北的经销商参加了发布会,并与“匠中匠”签署了总额3亿元、首款3千万元的经销合同。（江源荐，黄筱鹂编辑）

来源：贵州日报 2017-09-11

Factors Influencing the Determination of
Neotame Content in Baijiu by HPLC

LIU Shixue and TANG Liyun

(Yimeng Distillery Co.Ltd.,Linyi,Shandong 276700,China)

In this study,the factors influencing the determination of neotame content in Baijiu by HPLC were explored.The column of Agilent C18(5 μm,150 mm×4.6 mm)was adopted,a mobile phase of acetonitrile-ion pair reagent buffer at a flow rate of 1.0 mL/min was used,and column temperature was at 30℃with UV detector wavelength at 210 nm.The results suggested that neotame content in the range of 0.16 μg/mL to 25 μg/mL presented a good linear relation with peak area,the detection limit was 0.06 μg/mL,and the spiked recovery rate was between 93.75%to 98.13%.The method had the advantages including good separation,stable operation,and accurate data,and it was suitable for the determination of neotame content in Baijiu.

HPLC;neotame;Baijiu

TS262.3；TS261.7

A

1001-9286（2017）10-0084-04

10.13746/j.njkj.2017241

2017-09-11

刘石雪，女，硕士研究生，E-mail：zhaoweishan1986@163.com。

唐丽云，女，国家级白酒评委，主要研究方向：白酒产品研发，E-mail：lytliyun@163.com。

优先数字出版时间：2017-09-14；地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20170914.1422.003.html。