不同强度运动结合白藜芦醇对老年肥胖大鼠RBP4的影响*

崔嘉琴， 柏友萍， 苏 敏， 宋威巍， 林 潺， 吴 琳， 张皓月

(安徽师范大学体育学院， 芜湖 241003)

不同强度运动结合白藜芦醇对老年肥胖大鼠RBP4的影响*

崔嘉琴， 柏友萍△， 苏 敏， 宋威巍， 林 潺， 吴 琳， 张皓月

(安徽师范大学体育学院， 芜湖 241003)

目的探讨不同强度运动结合白藜芦醇对老年肥胖大鼠内脏脂肪组织视黄醇结合蛋白4(RBP4)mRNA蛋白表达及血浆RBP4浓度的影响。方法选择鼠龄3周的雄性SD大鼠80只，随机分为对照组和实验组：对照组(C)饲喂6.0%脂肪的普通饲料(n=12)；实验组分3个阶段饲喂36%～40%高脂饲料(n=68)。建立老年肥胖大鼠模型，选取24只建模成功的肥胖大鼠随机分为4组(n=6)：肥胖对照组(CO)、白藜芦醇组(RO)、低强度运动+白藜芦醇组(LRO)、中强度运动+白藜芦醇组(MRO)。LRO组和MRO组的运动强度分别为(12 m/min×15 min)和(15 m/min×15 min)，每天运动60 min；补充白藜芦醇各组52.5 mg/kg·d灌胃1次，对照组采用等量的纯净水灌胃，持续干预8周。8周后采血和肾周、睾周、血管及内脏脂肪组织，检测血糖和血浆RBP4浓度、计算胰岛素敏感性(ISI)，检测RBP4 mRNA和蛋白表达。结果与正常组比较，模型组大鼠RBP4 mRNA和蛋白表达、血浆浓度及血糖指标明显升高(P<0.05，P<0.01)，ISI明显降低(P<0.05)；与模型组比较，RO、LRO组和MRO组大鼠RBP4 mRNA和蛋白表达、血浆浓度及血糖指标明显降低(P<0.05，P<0.01)，ISI明显升高(P<0.05)；RO、LRO组和MRO组之间比较，MRO组大鼠RBP4 mRNA和蛋白表达、血浆浓度及血糖指标明显降低，ISI明显升高，但无显著差异。结论不同强度运动结合白藜芦醇能降低老年肥胖大鼠内脏脂肪组织RBP4 mRNA和蛋白表达及血浆RBP4浓度，受运动强度影响较小。

运动强度；白藜芦醇；老年肥胖；RBP4

随着人口老龄化，老年肥胖率呈逐年上升趋势，老年患者已是慢性代谢性疾病和心血管疾病的高发人群。肥胖可以引起胰岛素抵抗(insulin resistance，IR)，导致血糖和血脂代谢紊乱，是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)的独立危险因素[1]。T2DM是继心脑血管疾病和恶性肿瘤之后的第三大非传染性慢性疾病，其关键因素是胰岛素敏感性(insulin sensitivity，ISI)的降低[2]。视黄醇结合蛋白4(retinol binding protein 4，RBP4)是一种能够诱导IR的多功能脂肪因子，其水平升高可以引起胰岛素信号传导功能异常，是肥胖、T2DM、代谢综合症等IR相关疾病的主要发病机制之一[1]。

运动可以增加机体能量消耗，促使脂肪氧化分解，提高骨骼肌细胞转运和利用葡萄糖的能力，促进ISI的提高，降低血糖[3]。白藜芦醇(resveratrol，Res)是一种天然存在的非黄酮类多酚化合物，具有多重生物活性，其可改善IR、高血糖和脂代谢紊乱[4]。本研究前期发现[5]通过不同强度运动对青春期肥胖大鼠的内脏脂肪组织RBP4 mRNA、肝脏组织蛋白表达和血浆浓度能起到降低效果，且提高ISI及降低血糖。但不同强度运动结合Res对老年肥胖大鼠RBP4的影响目前尚不清楚，RBP4在老年肥胖过程中起到怎样的生理作用至今研究仍较少。本实验通过高脂饲料诱导建立老年肥胖SD大鼠模型，采用低和中强度运动结合Res的综合实施于受试鼠，对受试鼠内脏脂肪组织RBP4的转录与翻译及血浆浓度进行比较分析，为完善运动结合Res对老年肥胖大鼠RBP4的生理机制提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

仪器：全自动生化分析仪(日立7060)，酶标仪(Tecan Sunrise/瑞士)，洗板机(Tecan Columbus Washer/瑞士)；6跑道大鼠跑台(Wi32812/北京)。台式高速离心机(eppendorf，Centrifuge5417)，PCR仪(MJ research，PTC200)，实时荧光定量PCR仪(博日，line-gene K FQD-48A)。高速冷冻离心机(力康生科，Neofuge15R)，可见紫外分光光度计(日立，U-2001)，凝胶成像系统(江苏捷达科技，JD801)。

试剂：M-MLV反转录酶(Promega，M1705)，Trizol(SunShineBioTM，SN114)；6×SDS protein Loading buffer(还原型，SunShineBioTM，SN336)，PVDF膜(Millipore)，兔抗RBP4抗体(Bioss，bs-6182R)，羊抗兔IgG-HRP(H+L)(SunShineBioTM，SN134)，羊抗小鼠IgG-HRP(H+L)(SunShineBioTM，SN135)，大鼠抗β-actin抗体(Boster，BM0627)，PageRuler Prestained Protein ladder(Fermentas，SM0671)。血糖试剂盒(北京利德曼生化股份有限公司)。 美国TSZ公司生产的大鼠血浆胰岛素和RBP4 ELISA试剂盒(上海研域生物科技有限公司代理)。

1.2 老年肥胖大鼠建模与分组

本实验对象选择清洁级雄性SD大鼠80只，鼠龄3周，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司[许可证号：SCXK (沪) 2012-0002，合格证号：2007000546402]。幼鼠体重(74.12±7.39)g，先适应性喂养1 d，随机分为对照组和实验组，体重无差异。对照组12只，饲养普通饲料(M01-F-)(能量营养素比例：碳水化合物67.6%，脂肪6.0%，蛋白质26.4%)；实验组68只，分3个阶段饲喂高脂饲料，即：第1阶段(第4～10周)饲喂36%脂肪供能高脂饲料(M04-F-)(能量营养素比例：碳水化合物45.0%，脂肪36.3%，蛋白质18.7%)，第2阶段(第31～32周)和第3阶段(第56～60周)喂40%脂肪供能高脂饲料(PSY1102-)(能量营养素比例：碳水化合物40.0%，脂肪40.0%，蛋白质20.0%)，其他时间段均喂普通饲料。这三个阶段喂高脂饲料进行催肥，主要是考虑人在生命过程中经历的生长发育期、壮年期和老年期3个发展时期[6]。

根据老年大鼠肥胖成功标准(60周龄，肥胖组体重>对照组体重120%[7])，在建模成功中选取24只肥胖大鼠，随机分为4组：肥胖对照组(control obese group，CO)、补充白藜芦醇组(resveratrol obese group，RO)、低强度运动+白藜芦醇组(low intensity exercise combined with resveratrol obese group，LRO)、中强度运动+白藜芦醇组(moderate intensity exercise combined with resveratrol obese group，MRO)，选择自然生长老年大鼠为空白对照(control group，C)。干预期间，大鼠分笼饲养(3只/笼)，各组均喂普通饲料，饲料每天定量供给，30 g/d，自由饮水，饲养房的温度为(20℃±2℃)，相对湿度(50%-70%)，每天光照为12 h，每周测量1次体重。该项研究获得安徽师范大学动物伦理学会的同意(20130225)。实验中对动物的处理方法符合中华人民共和国科学技术部颁发《关于善待实验动物的指导性意见》[8]。

1.3 运动结合实验的设计与实施

本次运动方案以Bejma等[9]和本实验室前期的动物运动方案[5]为依据进行改进，跑台坡度为0°。老年大鼠开始进行2～3次/天的适应性跑台练习，训练5 d。运动强度的设计为低和中，低强度运动为12 m/min×15 min(负荷强度相当于50%～60% VO2max[9])，中强度运动为15 m/min×15 min(负荷强度相当于65%～75% VO2max[9])，4组/次，组间休息5 min，60 min/d。Res方案采用52.5 mg/kg·d灌胃(Res纯度为99%，购于中国陕西天行健生物工程股份有限公司)，对照组采用同等剂量的纯净水。每日运动后休息1 h补充Res 1次，5次/周，周二、周五休息，持续干预8周。

1.4 样本采集与保存

8周干预后，对实验大鼠禁食12 h，禁水6 h。用10%水合氯醛溶液，剂量为1.22 ml/kg腹腔注射麻醉，麻醉成功后剖腹取腹主动脉血，分离血浆，部分采用全自动生化仪测定血糖，部分保存在-80℃冰箱待ELISA测血RBP4浓度。采集肾周和睾周脂肪组织。取部分含血管少的脂肪立即置于Trizol中，保存在-80℃冰箱，用qRT-PCR测RBP4 mRNA表达。取部分内脏脂肪组织用铝箔纸包好保存在-80℃冰箱，用Western blot测RBP4蛋白表达。

1.5 qRT-PCR检测脂肪组织中RBP4 mRNA表达

根据GenBank SD大鼠RBP4基因外显子序列设计引物，委托上海生工技术有限公司合成。RBP4引物：F：5’-CACAGAAGATCCTGCCAAGTTCA-3’，R：5’-CAGAGCGAAGGTGTCGTAGTC-3’；β-actin引物：F：5’-CTAGAGGGTGTCCGCAATG-3’，R：5’-CAGTGGGAAGGTGTAGTCAGTC -3’。

利用 Trizol 提取总RNA，将RNA逆转录为cDNA。PCR扩增：95℃预变性2 min，95℃变性10 s→60℃退火60 s→60℃延伸60 s，40次循环；72℃末段延伸5 min；熔解曲线：温度60℃～95℃，温度间隔0.3℃，时间5 s/count，RBP4 Tm值为83℃。检测：台阶。按照上述实验方法得出数据，阈值与Ct值由软件自动得出。采用2-△Ct法来进行相对定量，

△Ct=Ct(目的基因)- Ct(β-actin)。

1.6Westernblot法检测内脏脂肪组织RBP4蛋白表达

先在5%浓缩胶中以80 V电泳至分离胶，后在10%分离胶中以120 V继续电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。将凝胶上的电泳蛋白质转移至 PVDF膜上，250 mA转移 1.5 h后，将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1 h。接着加入内参一抗1∶1 000 稀释、兔抗1∶500稀释、4℃孵育过夜，TBST洗膜后，同上方法准备二抗稀释液(1∶2 000)并与膜接触，室温下孵育1 h。TBST洗膜后，滴加化学发光试剂，显影、定影，将胶片进行扫描，采用凝胶成像系统和Image J2软件分析目的条带净光密度值，以β-actin作为内参照，进行半定量分析。

1.7 ELISA检测血浆胰岛素和RBP4浓度

血浆胰岛素和RBP4浓度采用ELISA的双抗体夹心法测定标本中大鼠RBP4水平。ELISA操作方法严格按照试剂盒使用说明书提供的程序进行。RBP4浓度值及胰岛素浓度值：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线。RBP4曲线方程为y=0.046x+0.020，标准品试剂测量值与实际测量值相关系数r=0.999；胰岛素曲线方程为y=0.020x+0.008，标准品试剂测量值与实际测量值相关系数r=0.999，把该方程代入Excel工作表中，得到相应的浓度值，此浓度值再乘以5为样本实际浓度。ISI利用定量评价指标QUICKI(quantitative insulin sensitivity check index，QUICKI)指数评定，根据公式QUICKI = 1/[log(I0)+log(G0)]计算，I0代表空腹胰岛素含量(mU/L)，G0代表空腹血糖浓度(mmol/L)[10]。

1.8 统计方法

2 结果

2.18周干预后内脏脂肪组织RBP4mRNA表达和血浆RBP4浓度比较

RBP4 mRNA表达CO组明显高于C组，差异显著(P<0.05)。RO、LRO及MRO三组均明显低于CO组，差异显著(P<0.05，P<0.01)，其中RO组和MRO组低于LRO组，MRO组低于RO组，但差异不显著。血浆RBP4浓度CO组明显高于C组，差异显著(P<0.05，P<0.01)。RO、LRO及MRO三组均明显低于CO组，且有非常显著性差异(P<0.05，P<0.01)，其中LRO和MRO组低于RO组，MRO组低于LRO组，但差异不显著(表1)。

GroupnRBP4mRNARBP4(μg/L)C52.098±0.15413.022±2.201CO52.634±0.447*16.000±1.536**RO61.836±0.327##13.587±0.067#LRO52.131±0.111#12.978±1.692##MRO51.732±0.244##12.022±1.642##

C： Control group； CO： Control obese group； RO： Resveratrol obese group； LRO： Low intensity exercise combined with resveratrol obese group； MRO： Moderate intensity exercise combined with resveratrol obese group; RBP4: Retinol binding protein 4

*P<0.05,**P<0.01vsC group；#P<0.05,##P<0.01vsCO group

2.2 8周干预后内脏脂肪组织RBP4蛋白表达

CO组内脏脂肪组织RBP4蛋白表达高于C组；RO、LRO及MRO三组内脏脂肪组织RBP4蛋白表达均明显低于CO组，且RO、LRO及MRO三组间差异不显著(图1)。

Fig.1Comparison of protein expression in RBP4 of rats among group after the experiment

C： Control group； CO： Control obese group； RO： Resveratrol obese group； LRO： Low intensity exercise combined with resveratrol obese group； MRO： Moderate intensity exercise combined with resveratrol obese group; RBP4: Retinol binding protein 4

2.3 8周干预后ISI和血糖比较

ISI CO组明显低于C组，差异显著(P<0.05)。LRO和MRO组明显高于CO组，差异显著(P<0.05)；RO组高于CO组，但差异不显著。LRO和MRO组高于RO组，MRO组高于LRO组，但差异不显著。血糖CO组明显高于C组，差异显著(P<0.05，P<0.01)。MRO组明显低于CO组，差异显著(P<0.05)，RO和LRO组血糖低于CO组，但差异不显著(表2)。

GroupnISIBloodsugar(mmol/L)C50.394±0.01911.636±3.568CO50.369±0.017*17.930±6.094**RO60.381±0.01015.242±2.191LRO50.390±0.015#13.950±2.260MRO50.391±0.009#12.894±2.642#

C： Control group； CO： Control obese group； RO： Resveratrol obese group； LRO： Low intensity exercise combined with resveratrol obese group； MRO： Moderate intensity exercise combined with resveratrol obese group; RBP4: Retinol binding protein 4

*P<0.05,**P<0.01vsC group；#P<0.05vsCO group

3 讨论

随着年龄增长，老年人身体成分发生重要变化，老年人群倾向于肥胖化[11]。研究发现，脂肪组织是重要的内分泌器官，其分泌的细胞因子能以自分泌、旁分泌和远距离分泌等多种途径参与调节胰岛素在靶组织中的生物效应[12]。大量脂肪因子表达的增加或减弱，可从不同程度影响胰岛素效应，促成IR，进而形成T2DM[1]。

RBP4是新近发现的能导致IR的脂肪细胞因子，是单一肽链蛋白质，除了在肝脏中表达外，在脂肪组织尤其是内脏脂肪组织中高表达，是肥胖与T2DM之间的连接分子。Yang等[1]研究发现：RBP4抑制肌肉组织磷脂酰肌醇3激酶的活性和胰岛素受体后底物1的磷酸化，使其摄取葡萄糖减少；同时RBP4还诱导肝细胞表达糖异生的酶，增加肝糖输出，导致IR，从而参与糖尿病的发生与发展。Kloting等[13]研究证明，与正常者相比，肥胖患者内脏RBP4 mRNA升高约60倍，睾周脂肪RBP4 mRNA升高约12倍，提示内脏脂肪分泌的RBP4可能是肥胖患者RBP4的主要来源。常保荣等[14]研究发现，运动可以改善老年大鼠的食欲和身体成分，提高活动能力，减脂及降低体重。封飞虎等[15]采用运动与饮食对肥胖大鼠干预后发现，运动结合饮食可以降低腹内脂肪组织RBP4 mRNA表达水平。林宇峰等[16]通过对T2DM肥胖大鼠研究发现，8周耐力运动能够逆转受试鼠的脂肪组织RBP4蛋白表达水平的上调和降低血RBP4浓度，有效的改善了ISI及脂代谢。本实验发现，老年肥胖大鼠内脏脂肪组织RBP4 mRNA表达、蛋白表达、血浆浓度均显著增高，单纯补充Res和运动结合Res能明显降低其基因的转录与翻译以及血浆浓度，同时也低于正常老年大鼠。因该方面的研究文献很少，本人认为运动结合Res对RBP4的降低可能是预防老年人T2DM发生的有效保健措施，但确切机制有待进一步研究。

研究发现内脏型肥胖与糖尿病的相关性更强，运动可以改善T2DM大鼠脂代谢紊乱，降低血糖浓度，增加胰岛素的敏感性[17]。Lee等[18]在老年肥胖人群中研究RBP4和IR的关系，结果显示RBP4水平与空腹胰岛素、IR呈正相关，增加了糖尿病的发病风险。通过长期科学锻炼，可降低其IR，改善ISI，降低血RBP4水平，从而控制血糖波动、降低血糖。

Res及其衍生物是近年来研究较多的一类植物抗毒素，以反式和顺式两种同分异构体的形式存在[4]。研究发现[19]，Res可改善ISI，降低糖尿病动物的血糖，调节脂代谢异常，减少炎症因子的分泌和表达。曹姣等[20]通过有氧运动和Res对肥胖大鼠主动脉内皮细胞内分泌功能的影响研究发现，其联合干预改善肥胖大鼠脂代谢紊乱的效果优于单纯干预。

本研究发现老年肥胖大鼠血浆RBP4浓度明显增加，ISI降低，血糖升高。通过不同强度运动结合Res干预能够显著降低RBP4血浆浓度，提高ISI，降低血糖，受运动强度影响较小。运动结合Res联合作用效果明显优于单纯补充Res，说明补充Res在运动的刺激下能发挥更好的保健作用。

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EffectsofdifferentintensitiesexercisecombinedwithresveratrolonRBP4inagedobeserats

CUI Jia-qing, BAI You-ping△, SU Min, SONG Wei-wei, LIN Chan, WU Lin, ZHANG Hao-yue

(College of Physical Education，Anhui Normal University, Wuhu 241003, China)

Objective: To investigate the effects of different intensity exercise combined with resveratrol on retinol binding protein 4(RBP4) mRNA and protein expression in visceral adipose tissue and plasma RBP4 concentration of aged obese rats.MethodsEighty male SD rats aged 3 weeks were randomly divided into the control group and the experimental group. Rats of the control group(C) were fed with ordinary feed of 6% fat (n=12). The experimental group consisted of 68 rats, which were fed with 36%～40% high fat feed in three stages. The rat model of elderly obesity was established successfully. Twenty-four obese rats were selected and randomly divided into 4 groups, including obese group (CO), resveratrol obese group (RO), low intensity exercise combined with resveratrol group (LRO) and moderate intensity exercise combined with resveratrol group (MRO). There were 6 rats in each group. The exercise intensities of the LRO group and MRO group were (12 m/min ×15 min) and (15 m/min × 15 min). Every day was exercised for 60 minutes. The rats in RO, LRO or MRO were treated with resveratrol at the dose of 52.5 mg/kg·d, while the rats in the control group were fed with the same amount of purified water, continued intervention for 8 weeks. After 8 weeks, samples of blood, adipose tissue of around the kidney, testicle, vessel and visceral were collected. Blood glucose and plasma RBP4 concentration were measured. Insulin sensitivity(ISI) was calculated. The expressions of RBP4 mRNA and protein were also determined.ResultsCompared with normal (C) group, the expressions of RBP4 mRNA and protein and plasma concentration and plasma glucose of the model (CO) group were increased obviously (P<0.05,P<0.01). ISI was decreased obviously (P<0.05). Compared with model (CO) group, the expressions of RBP4 mRNA and protein and plasma concentration and plasma glucose of the RO and LRO and MRO groups were decreased significantly(P<0.05,P<0.01), while ISI was increased markedly (P<0.05). Compared with the RO and LRO groups, the expressions of RBP4 mRNA and protein and plasma concentration and plasma glucose of the MRO group were decreased, while ISI was increased, but there was no significant difference.ConclusionDifferent intensities exercise combined with resveratrol could reduce the RBP4 mRNA and protein expression in visceral adipose tissue and plasma RBP4 concentrations of aged obese rats, but less affected by exercise intensity.

exercise intensity; resveratrol; aged obesity; retinol binding protein 4

G804.2

A

1000-6834(2017)05-461-05

10.12047/j.cjap.5527.2017.110

安徽省高校自然科学基金重点(KJ2017A238)；安徽师范大学研究生科研创新与实践重点项目(2016yks011)

2016-11-24

2017-06-23

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Tel: 13956172806； E-mail: baiyouping@sohu.com