马齿苋多糖对小鼠抗炎及镇痛作用的实验研究

赵蕊，吴桐，陈昭，刘琦

马齿苋多糖对小鼠抗炎及镇痛作用的实验研究

赵蕊，吴桐，陈昭，刘琦

（黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319）

为了探讨马齿苋多糖的抗炎及镇痛作用。实验采用二甲苯导致小鼠急性炎症模型及棉球肉芽肿慢性炎症模型，将水提醇沉法制备的马齿苋多糖经口灌胃小鼠连续12 d，观察马齿苋多糖的抗炎活性。通过HE染色观察各组小鼠肝脏和肾脏的变化。并且通过热板法观察马齿苋多糖对小鼠的镇痛活性。结果显示：马齿苋多糖给药组对小鼠肝、肾无明显毒性，且高剂量马齿苋多糖给药组能显著降低二甲苯诱导小鼠的耳肿胀及明显抑制肉芽肿的增生，并能延长热板法导致小鼠的舔足反应潜伏期时间、减少舔足次数。结论：该实验结果显示，马齿苋多糖低毒、无副作用，对小鼠的急性和慢性炎症均表现明显的抑制活性，并表现出较强的镇痛活性。

马齿苋多糖；抗炎；镇痛

马齿苋，又名“长寿菜”是田头路边随处可见的一种药食两用的植物[1]。我国马齿苋资源丰富，储量大且无污染。马齿苋性寒，味甘酸，主入心、肝、脾、大肠经。主要功效是清热解毒、利水除湿、消肿散血、杀虫通淋等。药理学研究证实，马齿苋具有抗菌、降血脂、降血糖、增强免疫抗肿瘤等作用[2]。目前，手术切除、放疗和化疗是治疗恶性肿瘤的主要方法。这些方法都有明显的副作用，如白细胞减少并发炎症等。解决临床肿瘤患者疼痛也是医护人员面临的最大难题。多糖具有广泛的生理活性，越来越多的研究表明，植物中获取的多糖表现很强的免疫活性，一些提高机体免疫力的多糖已成为临床上治疗肿瘤的良好药物[3]。多糖是马齿苋中重要的生物活性物质之一。马齿苋多糖的提取、分离和纯化是研究其化学结构和表现出生物活性的基础。研究应用天然活性成分马齿苋多糖，观察其对小鼠的抗炎及镇痛活性，为临床马齿苋多糖作为抗肿瘤的辅助治疗奠定理论基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物：选取4周龄，体重20±2 g的 SPF级昆明雌性小鼠（购于长春医科大学实验动物中心）。

1.2 主要试剂：二甲苯分析纯为天津市天力化学试剂有限公司，批号：20120308。阿司匹林肠溶片为德国拜耳医药保健有限公司，批号：20130078。醋酸地塞米松为华润双鹤药业股份有限公司，批号：H11020537。

1.3 实验方法

1.3.1 马齿苋多糖制备

马齿苋采自黑龙江省大庆市喇嘛甸一带。称取500 g干燥马齿苋，粉碎，以甲醇回流脱脂后用80%乙醇回流去寡糖。残渣采用传统的水提醇沉法进行粗多糖制备[4]，简要过程如下：药材添加2 000 mL蒸馏水于95℃下提取，连续3次，每次进行2 h。合并3次提取后的滤液，减压蒸馏浓缩，在浓缩后的粗提液中加入95%的乙醇50 mL，置4℃冰箱中过夜，经3 000 r·min-1离心15 min后，所得沉淀物分别用95%的乙醇、无水乙醇、丙酮进行洗涤，最后真空干燥得马齿苋粗多糖，硫酸苯酚法测多糖含量。

1.3.2 小鼠急性炎症模型的建立与分组

50只小鼠，雌雄各半，随机分成5组，每组10只：模型对照组（灌胃生理盐水）、马齿苋粗多糖低剂量组（L：50 mg·kg-1）、中剂量组（M：100 mg·kg-1）、高剂量组（H：200 mg·kg-1）和阳性对照组（阿司匹林，4.17 mg·mL-1）。连续灌胃 12 天。末次给药后 60 min，在小鼠右耳两面均匀涂抹40 μL二甲苯，左耳作对照，30 min后，脱颈椎处死小鼠，沿耳廓线剪下双耳，用6 mm打孔器分别在两耳同一部位取下耳片，称重，以左右耳片质量差值表示炎性肿胀程度[5]。比较各组小鼠耳廓肿胀度（左耳耳片重—右耳耳片重），并计算肿胀抑制率。

耳廓肿胀抑制率＝对照组平均肿胀度-用药组平均肿胀度/对照组平均肿胀度×100%

1.3.3 小鼠慢性炎症模型的建立与分组

分组及给药途径同1.3.2，阳性对照组（地塞米松3 mg·kg-1）。乙醚麻醉，背部去毛消毒，将两个10 mg灭菌棉球分别植入小鼠两侧腋窝部皮下，术后次日开始用药，连续灌胃12 d。末次给药后60 min，处死小鼠，剥离肉芽组织，取出棉球，于60℃烤箱烘干后称重，肉芽肿净重=肉芽肿重量-原棉球重量。

1.3.4 马齿苋多糖的镇痛作用

用热板舔足反应观察马齿苋多糖对热刺激导致小鼠疼痛的镇痛作用[5]。待热板仪温度稳定在55℃时，将小鼠放入槽内，以小鼠舔右后足为疼痛反应指标预先测定痛阈值（以痛阈值平均值在5～30 s为合格小鼠）。 挑选合格小鼠50只，分组及给药途径同1.3.2，连续灌胃12 d。末次给药后60 min，观察小鼠舔足的反应潜伏期（即痛阈）及1 min内舔足的次数，计算痛阈提高的百分率。

痛阈提高百分率=（给药后平均痛阈值-给药前平均痛阈值）/给药前平均痛阈值×100%。

1.3.5 病理学检查

取适量肝、肾组织在4%中性多聚甲醛中固定，脱水、透明及石蜡包埋制片等处理，7 μm厚度切片。HE常规染色，中性树胶封片。光镜观察，记录病理形态学变化。

1.3.6 数据分析

数据采用SPSS15.0统计软件进行分析，所有的试验结果均以均数±标准误（x¯±S.D.）表示，多组间均数的比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），当方差齐时，组间均值两两比较采用LSD检验。P＜0.05为差异有显著性。

2 结果与分析

2.1 马齿苋多糖对小鼠肝、肾组织的影响

为了明确马齿苋多糖对小鼠的毒性大小，对各组小鼠肝、肾组织HE染色切片观察发现，光镜下，与正常对照组相比，各给药组小鼠肝小叶结构完整，中央静脉居中，肝索向四周呈放射状分布，肝细胞排列整齐，胞核清晰，胞浆丰富（图1）。与正常对照组相比，各给药组小鼠肾小球大小适中，结构完整，肾小管形态正常，无炎症细胞浸润和纤维组织增生（图1）。

图1 肝、肾组织形态学变化（HE×400）Fig.1 Morphological changes of liver and kidney tissue（HE×400）

2.2 马齿苋多糖的抗炎活性

2.2.1 对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响

为了检测马齿苋多糖的抗炎活性，马齿苋多糖灌胃小鼠12 d，通过建立二甲苯诱导的急性炎症模型观察马齿苋多糖对小鼠耳肿胀的抑制效果。结果显示，与模型对照组比较，马齿苋多糖中、高剂量组可明显降低二甲苯诱导的小鼠耳肿胀度（P＜0.05，P＜0.01）。阿司匹林组的小鼠耳肿胀度与模型对照组比较差异显著（P＜0.01），但是与马齿苋多糖高剂量组比较，无统计学差异（见表1）。因此，马齿苋多糖对急性炎症有抑制作用，且成剂量依赖性。

表1 马齿苋多糖对二甲苯诱导小鼠耳肿胀的影响Table 1 Effect of Portulaca oleracea L.polysaccharide on ear swelling model induced by xylol in mice

2.2.2 对棉球所致小鼠肉芽组织增生的影响

为了检测马齿苋多糖的抗炎活性，通过对慢性炎症小鼠给马齿苋多糖后观察小鼠肉芽组织增生的抑制效果。结果显示，与模型对照组比较，马齿苋多糖中、高剂量组可明显减少棉球肉芽肿净重（P＜0.05，P＜0.01）。地塞米松组的小鼠棉球肉芽肿净重与模型对照组比较差异显著（P＜0.01），但是与马齿苋多糖高剂量组比较，无统计学差异（见表2）。因此，马齿苋多糖对慢性炎症有抑制作用，且成剂量依赖性。

表2 马齿苋多糖对棉球所致小鼠肉芽组织增生的影响Table 2 Effect of Portulaca oleracea polysaccharide on granulation tissue hyperplasia induced by cotton ball in mice

2.3 马齿苋多糖的镇痛活性

为了了解马齿苋多糖的镇痛活性，通过检测热板法所致各组小鼠疼痛作用的影响。表3所示：与模型对照组比较，马齿苋多糖各剂量组小鼠的舔足反应潜伏期时间延长，舔足次数均有减少，且高剂量组效果优于低、中剂量组。阿司匹林组小鼠的舔足反应潜伏期时间显著延长，舔足次数显著减少，痛阈提高百分率为39.17%。与阿司匹林组小鼠比较，马齿苋多糖各剂量组小鼠的舔足反应潜伏期和舔足次数均有显著性差异。随着剂量的不断增加，痛阈提高百分率分别为12.45%、20.31%和27.25%。因此，马齿苋多糖对热源引起的疼痛有抑制作用，且成剂量依赖性，但是效果没有阿司匹林作用强。

表3 马齿苋多糖对热板所致小鼠疼痛的影响Table 3 Effect of Portulaca oleracea polysaccharide on ache induced by hot plate in mice

3 讨论

马齿苋在我国资源丰富，储量大且无污染，它不但具有一定的营养保健作用，且具有多种药理活性，被誉为21世纪最有发展的绿色食物之一。随着医疗卫生事业的发展，马齿苋越来越引起科研工作者的兴趣，并日益增进了对马齿苋药用价值的认识。马齿苋作为一种具有绿色型、环保型保健作用的功能性药物，备受人们的青睐，马齿苋的开发利用具有巨大潜力，为我们提出了许多新课题。多糖作为近年来的研究热点之一，它是一种重要的生命物质，因其参与了细胞的多种生命现象的调节，强化了机体自身的免疫功能，通过增强多种细胞因子的分泌，对肿瘤细胞起作用，同时对正常细胞无任何毒副作用，这有利于我们进一步开发新药，并不断扩展其在保健品、功能性食品中的应用，这是多糖区别于其他药物的一大优势。有关马齿苋多糖镇痛、抗炎活性的研究国内外尚未见报道，由于实验室已经证实马齿苋的粗多糖提取物对人宫颈癌细胞株Hela有很好的抑制作用[6-7]，为了深入地探讨，研究拟在我们已有工作的基础上，对马齿苋多糖的抗炎和镇痛活性进一步探索，为开发利用马齿苋作为高效、低毒的肿瘤辅助药物及探索癌症的中西医综合治疗提供实验理论依据。

炎症是多种疾病的病理过程，以红、肿、热、痛为主要表现。初期以急性炎症为主，逐渐迁延为慢性炎症。肿瘤的术后及放化疗患者由于机体的免疫力降低，易表现为炎症反应[8]。中医理论认为，炎症的临床表现以热毒炽盛等实热为主，中医临床治疗多采用清热解毒方药[9]。因此，研究应用炎症和疼痛动物模型评价马齿苋多糖的抗炎镇痛活性。二甲苯是化学致炎剂，可诱导炎症介质释放，导致局部毛细血管通透性增加、炎症细胞浸润引起水肿。中药创新药物研发中，常以二甲苯诱发小鼠耳壳急性肿胀，模拟机体急性炎症的病理状态，以评价药物抗炎活性。研究结果显示，马齿苋多糖对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀和棉球肉芽肿具有明显抑制作用，表明其对急性炎症和炎症后期结缔组织的生成均具有抑制作用。小鼠足底没有毛，皮肤裸露在外，在高温的热板刺激下会产生疼痛，小鼠表现出舔后足反应，热板法是研究药物镇痛活性的常用方法。研究结果显示，马齿苋多糖各剂量能使热疼痛导致的小鼠舔后足反应潜伏期延长，舔后足次数减少，其中高剂量镇痛效果最强。

研究过程中，我们选用临床上常用的抗炎镇痛药阿司匹林和地塞米松作为阳性对照药。马齿苋多糖高剂量组对急性炎症的效果与阿司匹林相似，但对热板所致的疼痛的改善不及阿司匹林。阿司匹林是通过抑制外周前列腺素的合成起抗炎、镇痛作用，但其具有抑制血小板聚集作用、恶心、呕吐、上腹部不适或疼痛等副作用[10]。马齿苋多糖高剂量组对慢性炎症的效果虽然不如地塞米松，但是两组无统计学差异。地塞米松是长效类糖皮质激素类药物，具有较多副作用，如满月脸、向心性肥胖、痤疮、多毛、高血压、高血脂、低血钾、肌肉萎缩、尿糖升高、骨质疏松、甚至股头坏死，以及胃溃疡、胃穿孔或诱发精神分裂症和癫痫等。我们的实验结果证实马齿苋多糖低毒无明显副作用，适用范围广，可作为临床长期应用的抗肿瘤辅助治疗药物。

4 结论

马齿苋多糖低毒、无副作用，对小鼠的急性和慢性炎症均表现明显的抑制活性，并表现出较强的镇痛活性。

［1］ Xiang L，Xing D，Wang W，et al.Alkaloids from Portulaca oleracea L［J］.Phytochemistry，2005，66：2595-2601.

［2］ Chen T ，Zhu L ，Liu X Y，et al.Synthesis and antioxidant activity of phosphorylated polysaccharide from Portulaca oleracea L.with H3PW12O40immobilized on polyamine functionalized polystyrene bead as catalyst ［J］.Journal of Molecular Catalysis A：Chemical，2011，342：74-82.

［3］ G Schwartsmann，M J Ratain，G MCragg，et al.Anticancer drug discovery and development throughout the world［J］.Journal of Clinical Oncology，2002，20：47S-59S.

［4］ 高莉，刘捷，田义静，等.马齿苋多糖提取、纯化工艺的初步研究［J］.食品研究与开发，2006，12(4）43-49.

［5］ 陈奇.中药药理实验方法学［M］.2版.北京：人民卫生出版社，2006.

［6］ 赵蕊，蔡亚平，陈志宝.马齿苋多糖对老龄荷瘤小鼠抗宫颈癌作用的研究［J］.中国老年学杂志，2013(33）：4480-4482．

［7］ R Zhao，X Gao，Y P Cai，et al.Antitumor activity of Portulaca oleracea L.Polysaccharides against cervical carcinoma in vitro and in vivo［J］.Carbohydrate Polymers，2013，96：376-383.

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［9］ 刁海涛，郑秀娟，周飞，等．应激对肉鸡盲肠菌群的影响及维生素C的缓解作用［J］．赤峰学院学报：自然科学版，2015，31（8 上）：34-36.

［10］ 宋祖益.近年来阿司匹林被发现的新作用及副作用［J］.中国实用医药，2013（8）：161-162.

Anti-inflammatory and Analgesic Study of Portulaca oleracea L.polysaccharide on Mice

Zhao Rui，Wu Tong，Chen Zhao，Liu Qi
(College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

The acute inflammation model induced by xylene and chronic inflammation model induced by cotton ball granuloma in mice were adopted to discuss the anti-inflammation and analgesic action of Portulaca oleracea L.polysaccharide.Portulaca oleracea L.polysaccharide was obtained by water extraction and alcohol precipitate method，and then the anti-inflammatory effects were evaluated by intragastric administration with Portulaca oleracea L.Polysaccharide for 12 d.The change of liver and kidney in mice was observed by HE dyeing.In addition，the analgesic effects were evaluated by hot-plate test.The experimental results showed that there was no obvious toxicity in liver and kidney of mice after treatment by Portulaca oleracea L.polysaccharide.And Portulaca oleracea L.polysaccharide of high dose group significantly suppressed xylene-induced ear edema in mice and significantly inhibited the proliferation of granuloma.Furthermore，the latency time of licking foot caused by hot plate method in mice was extended，but the number of times was reduced.The experimental results indicated that Portulaca oleracea L.polysaccharide was low toxicity and no side effects，and the inhibitory activity on acute and chronic inflammation was obvious，moreover the analgesic activity was significant.

Portulaca oleracea L.polysaccharides；anti-inflammatory；analgesia

R285

A

1002-2090（2017）05-0028-05

10.3969/j.issn.1002-2090.2017.05.008

2016-11-29

黑龙江省教育厅科研项目（马齿苋多糖对宫颈癌免疫逃逸作用的研究：12511370）。

赵蕊（1975-），女，副教授，燕山大学毕业，现主要从事中药药理及新药研究与开发方面的研究工作。