防风对痛泻要方活性成分在正常大鼠体内的药动学和组织分布的影响

梁瑞峰+葛文静+魏征+张雪侠+崔伟锋+刘雪+李更生

[摘要] 痛泻要方是治疗肝脾不和之痛瀉的经典方剂，方中防风具有引经作用。该研究采用超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS），以正负离子切换，多反应监测模式（MRM）同时测定大鼠灌胃不同配伍痛泻要方后血浆和组织中4种活性成分，比较不同配伍之间4种活性成分药动学和组织分布差异，探讨防风对痛泻要方主要成分的影响。研究发现，防风可提高芍药苷、橙皮苷的Cmax，AUC0-t，AUC0-∞，增加肝、脾、脑和小肠中白术内酯Ⅰ、芍药苷、橙皮苷的分布浓度，减少肺中白术内酯Ⅰ和没食子酸的分布；通过计算组织与血浆中的药物浓度比发现，防风可显著提高白术内酯Ⅰ、芍药苷、橙皮苷的脑/血浆比，降低白术内酯Ⅰ、芍药苷的肺/血浆比和芍药苷的脾/血浆比，推测防风可能通过增加痛泻要方有效成分的脑分布发挥引经作用。

[关键词] 防风； 痛泻要方； 药代动力学； 组织分布； 引经

[Abstract] Tongxie Yaofang （TXYF） is a famous formula that has been used for treating gastrointestinal diseases in traditional Chinese medicine（TCM）. Saposhnikoviae Radix is considered as a meridian guiding drug in TXYF and could enhance the effectiveness of prescription. However， the scientific evidence for this effect is still not clear. To reveal the interactions of Saposhnikoviae Radix with other herbs， we conducted this study on the pharmacokinetic profile and tissue distribution of active ingredients of TXYF in rats. The concentrations of four components in blood and tissues were determined by UPLC-MS/MS after oral administration with TXYF. The detection was carried out by electrospray ionization mass spectrometry in the multiple reaction monitoring （MRM） mode. The positive and negative ion switching technique was performed in the same analysis . The results revealed that Saposhnikoviae Radix could enhance Cmax， AUC0-t， and AUC0-∞ of paeoniflorin and hesperidin， and increase the distribution of atractylenolide-I， paeoniflorin and hesperidin in liver， spleen， brain and small intestine. Saposhnikoviae Radix increased the ratio of brain to blood concentrations of atractylenolide-I， paeoniflorin and hesperidin. Meanwhile， it reduced the ratio of lung to blood concentrations of atractylenolide-I and paeoniflorin. Saposhnikoviae Radix， and may enhance the effectiveness of prescriptions by promoting distribution of other herbs in brain.

[Key words] Saposhnikoviae Radix； Tongxie Yaofang； pharmacokinetic； tissue distribution； meridian guiding

痛泻要方由炒白术、炒白芍、炒陈皮、防风组成，最早见于《丹溪心法》，为治疗肝脾不和之痛泻的经典方剂，现在常用于肠易激综合征、结肠炎等^[1-2]。历代医家分析痛泻要方均认为，防风辛能疏散肝风，香可舒脾，又作为脾经引经之药，为该方佐使药。中医理论认为，引经药可改变其他药物的作用方向，使其作用侧重或集中于特定的部位，使药效靶向集中，提高疗效。现代研究表明引经药可通过增加靶组织中药物分布浓度而增强疗效^[3]。因此，本实验拟通过评价防风对痛泻要方活性成分药代动力学的影响，比较不同组方间药物组织分布的差异，为阐明防风的引经作用及机制提供依据。

1 材料

1.1 仪器与试剂

Acquity UPLC超高效液相色谱仪、Xevo TQS三重四极杆串联质谱仪（美国Waters公司），2K15型高速离心机（Sigma公司），AE240电子分析天平（瑞士Mettler公司），T18型匀浆机（德国IKA公司）。

炒白术、炒白芍、炒陈皮、防风购自河南省顺康医药有限公司，经河南省中医药研究院王慧森副研究员鉴定分别为菊科植物白术Atractylodes macrocephala Koidz. 的干燥根茎，毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall. 的干燥根，芸香科植物橘Citrus reticulata Blanco. 的成熟果皮和伞形科植物防风Saposhnikovia divaricata （Turcz.） Schischk. 的干燥根。白术内酯Ⅰ（111975-201501）、芍药苷（110736-201438）、没食子酸（110831-201605）、橙皮苷（110721-201316）、葛根素（110752-201514）、淫羊藿苷（110737-201516）购自中国食品药品检定研究院。甲醇（色谱纯，美国TEDIA公司），其余试剂为分析纯。

1.2 动物

雄性SD大鼠，SPF級，体质量180～200 g，由河南省实验动物中心提供，许可证号SCXK（豫）2015-0004。

2 方法

2.1 供试品的制备

痛泻要方（TXYF）提取液：炒白术-炒白芍-炒陈皮-防风6∶4∶3∶2称取药材适量，加10倍量70%乙醇加热回流提取2次，每次2 h，过滤，合并滤液，减压回收乙醇，浓缩至质量浓度为相当于含炒白术生药1.0 g·mL-1。痛泻要方缺防风（TXYF-FF）、痛泻要方倍用防风（TXYF+FF）提取液制备方法同TXYF，均浓缩至质量浓度为相当于含炒白术生药1.0 g·mL-1。

2.2 给药与样品采集

雄性SD大鼠18只适应性喂养1周后随机分为3组，每组6只，分别灌胃给予TXYF，TXYF-FF，TXYF+FF（20 mL·kg-1，成人临床剂量的10倍），于给药前及给药后0.25，0.5，0.75，1，1.5，2，3，4，6，8，10 h 经眼底静脉丛采血0.4 mL于肝素化试管中，3 000 r·min-1离心10 min，分离血浆，-20 ℃保存待测。另取SD大鼠18只适应性喂养后随机分为3组，每组6只，分别灌胃给予TXYF，TXYF-FF，TXYF+FF，按灌胃给药后1 h经眼底静脉丛采血0.4 mL，水合氯醛麻醉后取心、肝、脾、肺、肾、脑、小肠，-20 ℃保存待测。

2.3 样品处理

分别精密称取大鼠心、肝、脾、肺、肾、脑、小肠样品0.3 g，加入生理盐水0.6 mL冰浴中匀浆，制备匀浆液。精密吸取300 μL匀浆液或150 μL血浆，加入15 μL混合内标溶液（葛根素1.25 mg·L-1，淫羊藿苷0.5 mg·L-1）混匀，加1.2或0.6 mL甲醇，涡旋1 min，4 ℃ 12 000 r·min-1离心10 min，取上清液40 ℃氮气吹干，残渣用100 μL 30%甲醇溶解，进样检测分析。

2.4 样品分析方法的建立与验证

2.4.1 色谱条件 色谱柱为ACQUITY UPLCTM BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；柱温30 ℃；流动相甲醇（A）- 0.1%甲酸水（B）梯度洗脱：0～2 min，5%～30% A；2～5 min，30%～80% A；5～8 min，80% A；8～10 min，5% A，流速0.3 mL·min-1，进样量5 μL。

2.4.2 质谱条件 电喷雾电离源（ESI），毛细管电离电压3.0 kV，离子源温度120 ℃，去溶剂气温度350 ℃，去溶剂气流速650 L·h-1，锥气流速为50 L·h-1，采用正、负离子切换检测模式（正离子模式：白术内酯Ⅰ、橙皮苷及内标淫羊藿苷；负离子模式：芍药苷、没食子酸及内标葛根素），多反应监测（MRM）扫描。4种待测成分及内标的主要质谱参数见表1。

2.4.3 溶液的配制 精密称取白术内酯Ⅰ、芍药苷、没食子酸和橙皮苷适量，以甲醇为溶剂配制白术内酯Ⅰ、芍药苷、没食子酸和橙皮苷质量浓度分别为32，400，160，40 mg·L-1的混合储备液，并经逐级定量稀释成白术内酯Ⅰ依次为0.04，0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，3.2 mg·L-1；芍药苷依次为0.5，1.25，2.5，5，10，20，40 mg·L-1；没食子酸依次为0.2，0.5，1，2，4，8，16 mg·L-1；橙皮苷依次为0.05，0.125，0.25，0.5，1，2，4 mg·L-1的系列对照贮备液。内标溶液配制：精密称取葛根素、淫羊藿苷适量，用甲醇溶解配制成1.25，0.5 mg·L-1的混合内标溶液。

2.4.4 专属性考察 精密吸取大鼠的空白血浆150 μL或组织匀浆液300 μL，按2.3项下操作，进行分析，获得大鼠空白血浆色谱图，空白对照大鼠血浆加入混合对照品溶液，大鼠给药后收集的血浆样品。

2.4.5 标准曲线和线性范围 取离心管分别精密加入不同浓度的对照品液15 μL，氮气吹干，加入大鼠空白血浆150 μL，涡旋混匀，制备成白术内酯Ⅰ为4，10，20，40，80，160，320 μg·L-1；芍药苷依次为50，125，250，500，1 000，2 000，4 000 μg·L-1；没食子酸依次为20，50，100，200，400，800，1 600 μg·L-1；橙皮苷依次为5，12.5，25，50，100，200，400 μg·L-1的系列对照品溶液，按2.3项下操作分析，每个浓度平行处理5份。以药物与相应内标的色谱峰面积比（Y）为纵坐标，样品质量浓度（X）为横坐标进行线性回归，得相应的回归方程。参照上述方法，每种组织匀浆样品建立相应的标准曲线，以计算该组织样品中白术内酯Ⅰ、芍药苷、没食子酸和橙皮苷的浓度。

2.4.6 基质效应考察 吸取大鼠空白血浆150 μL或组织匀浆液300 μL，加入0.6 mL甲醇，涡旋1 min，4 ℃ 12 000 r·min-1离心10 min，取上清液40 ℃氮气吹干，加入对照品溶液和内标溶液，配制白术内酯Ⅰ等4种成分血浆或组织匀浆液高、中、低3个质量浓度（白术内酯Ⅰ质量浓度为10，40，160 μg·L-1；芍药苷质量浓度为125，500，2 000 μg·L-1；没食子酸质量浓度为50，200，800 μg·L-1；橙皮苷质量浓度为12.5，50，200 μg·L-1）的质量控制（QC）样品各5份，进样测定，计算各浓度水平待测溶液的平均浓度C1。另取对照品溶液和内标溶液，配制高、中、低3个质量浓度的对照溶液各5份进样测定，计算各浓度标准溶液的平均浓度C2，按照公式计算：基质效应=C1/C2×100%。

2.4.7 提取回收率 分别配制血浆或组织匀浆液高、中、低3个质量浓度的QC样品，每个质量浓度平行处理5份，按2.3项下进行操作处理分析，分别测定血浆或组织中3种成分浓度，与真实值比较计算回收率。

2.4.8 准确度与精密度 分别配制血浆或组织匀浆液高、中、低3个质量浓度的QC样品，每个质量浓度平行处理5份，连续测定3 d，计算其日内和日间准确度与精密度。

2.4.9 稳定性 分别配制血浆或组织匀浆液高、中、低3个质量浓度的QC样品，每个质量浓度平行处理5份，室温下放置24 h、经3次冻融循环以及-70 ℃存放30 d后，按2.3项下进行操作处理分析。

2.5 统计分析

用药物代谢动力学分析软件DAS 2.0对数据进行处理，以统计矩法计算药代动力学参数。采用SPSS 17.0软件对数据进行正态性分析后，独立样本t检验进行组间比较，P<0.05为有显著性差异。

3 结果

3.1 方法学考察

3.1.1 专属性考察 分别取大鼠空白血浆、加入4种待测成分对照品及混合内标的血浆、灌胃TXYF后60 min大鼠血浆各150 μL，按2.3项下进行操作处理，进样分析并记录色谱图，结果表明血浆中内源性物质不干扰待测成分的测定，见图1。

3.1.2 标准曲线和线性范围 以被测药物与相应内标的峰面积之比（Y）对质量浓度（X）进行线性回归，计算回归方程，结果表明各成分在相应的线性范围内关系良好，见表2。

3.1.3 基质效应分析 本实验条件下，大鼠血浆中基质效应影响较小，白术内酯Ⅰ、芍药苷、没食子酸、橙皮苷的基质效应92.09%～106.2%，表明基质对待测物质无明显的离子抑制或增强效应，见表3。

3.1.4 回收率分析 待测物质的提取回收率在78.95%～89.31%，表明本方法的回收率达到生物样品的测定要求，见表3。

3.1.5 准确度与精密度分析 各待测物在血浆中的日内和日间精密度RSD均小于15%，表明本方法符合生物样品精密度的要求，见表4。

3.1.6 稳定性分析 稳定性试验表明血浆样品室温下放置24 h、经3次冻融循环以及-70 ℃存放30 d条件下供试品稳定性良好，见表5。

3.2 药代动力学分析

血浆样品检测分析后，代入标准曲线计算血药浓度，以血药浓度（C）对时间（t）作图，得到相应的血药浓度-时间曲线见图2，各成分药代动力学参数见表6。

3.3 组织分布分析

大鼠灌胃不同配伍痛泻要方1 h后，测得4种活性成分在不同组织中的分布情况见图3，组织与血浆的药物浓度比见表7。结果显示，与TXYF-FF组比较，TXYF，TXYF+FF组大鼠肝、脾、脑和小肠组织中白术内酯Ⅰ、芍药苷、橙皮苷的浓度增加，肺中白术内酯Ⅰ和没食子酸的分布减少（P<0.05，P<0.01）。计算组织与血浆的药物浓度比值表明，与TXYF-FF组比较，TXYF，TXYF+FF组大鼠白术内酯Ⅰ、芍药苷、橙皮苷的脑/血浆比增加，白术内酯Ⅰ、芍药苷的肺/血漿比和芍药苷的脾/血浆比降低（P<0.05，P<0.01）。

4 讨论

痛泻要方为《景岳全书》所载的经典名方，由白术、白芍、陈皮及防风组成，具有健脾舒肝、止痛止泻的作用，防风为该方使药，除有柔肝舒脾、燥湿止泻的功效外，还是脾经引经之药。研究表明^[4]，防风可显著增强方中其他药物的止痛止泻效应，增强对炎症介质的抑制作用。引经药可通过增加靶组织的药物分布发挥引经作用。冰片具有“芳香走窜，引药上行”的特性，常与其他中药伍用治疗脑部疾病，实验证实，冰片可增强山柰酚、尼莫地平等药物在脑内的浓度，从实验证实了冰片的脑靶向增强作用^[5-6]；“性善下行”之牛膝能够提高小檗碱在下肢关节组织的靶向分布，具有靶向引导作用^[7]；柴胡、吴茱萸可增加黄连生物碱在肝脏中的浓度，从而发挥引经作用^[8-9]。

大鼠灌胃不同配伍的痛泻要方后，通过与TXYF-FF组比较发现，防风可显著提高芍药苷、橙皮苷的Cmax、AUC0-t，AUC0-∞，而对白术内酯Ⅰ、没食子酸的药动学行为影响不大。组织分布研究表明防风对白术内酯Ⅰ、芍药苷、没食子酸、橙皮苷的影响较为复杂，防风可提高肝、脾、脑和小肠中白术内酯Ⅰ、芍药苷、橙皮苷的浓度，减少肺中白术内酯Ⅰ和没食子酸的分布。防风为脾经引经药，脾主运化，与肝、脾和小肠等消化器官的功能密切相关，而且研究表明^[10]，脑可通过脑-肠轴调节胃肠消化功能，防风提高有效成分在肝、脾、脑、小肠中的浓度，这可能是防风引经的作用机制。进一步计算组织与血浆中的药物浓度比发现，防风可显著提高白术内酯Ⅰ、芍药苷、橙皮苷的脑/血浆比，降低白术内酯Ⅰ、芍药苷的肺/血浆比和芍药苷的脾/血浆比，说明防风不仅促进有效成分向靶组织的分布，而且减少在非靶组织中的分布。

中枢神经系统可通过脑-肠轴调节胃肠运动，由于脑肠轴的存在，构建起脑和肠道功能整合的神经介质的双向应答系统。防风可能通过增加痛泻要方活性成分在脑中的分布，进而通过脑肠互动途径发挥引经增效作用。由于药物的分布受药物理化性质、机体生理屏障、药物转运体等多种因素影响，防风通过何种途径增加相关活性成分的组织分布需进一步深入研究。

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[责任编辑 张燕]