一株泰山黄精内生真菌的分离及其抗氧化活性初步研究*

杨洪芸 黄巧丽 刘振亮 刘鑫鑫 卢 毅 崔 萌 孙立彦

(泰山医学院，山东 泰安 271016)

一株泰山黄精内生真菌的分离及其抗氧化活性初步研究*

杨洪芸 黄巧丽 刘振亮 刘鑫鑫 卢 毅 崔 萌 孙立彦

(泰山医学院，山东 泰安 271016)

目的 药用植物内生真菌是一类重要的微生物资源，本研究从泰山黄精根茎中分离纯化内生真菌，并对其抗氧化性进行研究。方法 采用组织贴片培养分离法进行内生真菌的分离培养，采用DPPH法和铁氰化钾还原力法测定抗氧化性。结果 从黄精根茎中分离纯化到1株内生真菌HJG3。在测试浓度范围内，对DPPH自由基清除率及其还原能力与浓度均呈明显的量效关系，其IC50值为14.0262 mg/ml， EC50值为1.8475 mg/ml。结论 泰山黄精中有内生真菌存在，其内生真菌HJG3有一定抗氧化性，是筛选天然生物活性成分的潜在资源。

泰山黄精；内生真菌；抗氧化活性

内生真菌是指生活史的全部或某一阶段生活在植物组织内，对植物组织没有造成明显病害的真菌[1]。第一株内生真菌是1898年由Vogl 从黑麦草Lolium perenne L.种子种分离获得，到20世纪80年代，有关植物内生真菌的研究得到重视，对内生真菌的研究广泛开展起来[2]。内生真菌可能产生与宿主相似或相同的具有生物活性的次生代谢产物，这些活性产物具有抗菌、抗氧化和抗肿瘤等生物活性。从内生真菌代谢产物中寻找抗菌、抗氧化和抗肿瘤活性物质已成为人们研究热点[3]。最近从蒺藜[4]、南北五味子[5]、宁夏枸杞[6]等药用植物植物中分离的内生真菌则可合成抗氧化活性物质。

黄精Polygonatum sibiricum Delar ex Redoute, 又名黄蔓精、老虎姜、鸡头参、鸡头精等，是双子叶百合科植物，是泰山四大名药之一[7]。黄精作为常用补益药，有着两千多年的药用历史，具有补气养阴、润肺、健脾和益肾功效，临床上常用于治疗肺虚燥咳、脾胃气虚和精血不足等，也可用于治疗糖尿病和肺结核等病，同时又是数十种滋补性中医复方或中成药的重要组分[8-9]。

由于黄精市场需求量高，长期以来被人类过度采挖，自然繁殖率低，使得黄精的野生资源越来越匮乏[10]。目前，对黄精内生真菌的研究仅见李艳玲等抑菌活性研究和汪滢等抗菌代谢产物研究[10-11]。未见黄精内生真菌的抗氧化活性研究报道。本课题组对泰山黄精根茎进行了内生真菌分离并对分离得到的一株内生真菌进行了抗氧化活性研究，希望能为黄精资源的综合开发利用提供一定理论依据。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1植物材料 黄精根茎健康组织采自泰山四大名药种植基地，24 h内处理。

1.1.2培养基和主要试剂 真菌分离培养基 PDA培养基(马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 ml)。真菌种子发酵培养基： PD培养基(马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1000 ml)。固体发酵培养基：大米培养基。

主要试剂：2，6-二叔丁基对甲苯酚BHT(国药集团化学试剂有限公司)；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼DPPH(Sigma公司)；铁氰化钾(天津市博迪化工有限公司)；维生素 C(中国药品生物制品检验所)；琼脂粉(天津市承大化学试剂研发中心)；磷酸氢二钠和磷酸二氢钠(天津市博迪化工有限公司)等。

1.1.3仪器 UV-2550 紫外分光光度计(岛津制作所)； MJX-320多段编程霉菌培养箱(宁波市科技园区新江南仪器有限公司)；SW-CG-RF超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；LDZX-40BI立式自动电热压力蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)；FC-104电子分析天平(上海恒平科学仪器有限公司)等。

1.2试验方法

1.2.1内生真菌分离纯化与保存[12-13]内生真菌的分离采用组织块法，黄精根茎用自来水冲洗，然后依次用75%乙醇漂洗1 min，5.0%的次氯酸钠漂洗5 min，75%乙醇漂洗30 s，无菌水漂洗5 次以进行表面消毒。用无菌刀片将材料切成5～10 mm的片段，贴于PDA培养基上，28 ℃恒温箱中培养5～7 d，同时，将表面消毒的植物组织片段不经剪切直接在培养基表面轻抹，相同条件下培养作为对照，培养3 d后对照培养基中无真菌长出，证明表面消毒彻底，分离得到的真菌是植物内生真菌。每培养皿接4个组织块，观察材料切口处长出菌丝(菌落)，采用尖端菌丝挑取法取切口处菌丝，转接至新的PDA培养基上继续培养、纯化，纯化后转接到PDA斜面上编号并4 ℃保存。

1.2.2制备样品粗提物 制备HJG3种子发酵液(25 ℃，120 rpm，5 d)，在大米固体培养基上25 ℃发酵培养20 d，用乙酸乙酯浸提真空浓缩得其粗提物，用于抗氧化实验研究。

1.2.3抗氧化方法[14-15]

1.2.3.1DPPH自由基清除率的测定 DPPH溶液的配制：用无水乙醇配置0.12 mg/ml DPPH母液，避光保存，备用。用时无水乙醇稀释3倍，得0.04 mg/ml DPPH溶液。样品溶液的配制：用无水乙醇配制浓度梯度为8 mg/ml、4 mg/ml、2 mg/ml、1 mg/ml、0.5 mg/ml、0.25 mg/ml样品溶液。对照品溶液的配制：用无水乙醇配制浓度梯度为0.5 mg/ml、0.25 mg/ml、0.125 mg/ml、0.0625 mg/ml、0.03125 mg/ml、0.015625 mg/ml的阳性对照Vc和BHT。自由基清除率的测定：各取不同浓度的样品溶液0.5 ml于试管中，再加入0.04 mg/ml DPPH 自由基溶液3.5 ml，混匀， 25 ℃水浴黑暗反应30 min，静置10 min后，取上清液于517 nm 处测其吸光度As；另各取不同浓度的样品溶液0.5 ml于试管中，分别加入无水乙醇3.5 ml，25 ℃水浴黑暗反应30 min，静置10 min后，取上清液于517 nm处测其吸光度Ab；以 0.04 mg/ml DPPH自由基溶液3.5 ml和无水乙醇0.5 ml反应作为参比，测其吸光度Ao。每个浓度组平行测定三次，取平均值，结果以自由基清除率E表示，E(%)=[Ao-( As-Ab)]/Ao×100%。

1.2.3.2铁氰化钾还原力的测定 样品溶液的配制：用无水乙醇配制浓度梯度为8 mg/ml、4 mg/ml、2 mg/ml、1 mg/ml、0.5 mg/ml、0.25 mg/ml、0.125 mg/ml、0.0625 mg/ml的样品溶液。阳性对照Vc溶液的配制：用无水乙醇配制浓度梯度为1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625 mg/ml的Vc溶液。还原力的测定：精确移取1 ml不同浓度的样品溶液，依次加入磷酸缓冲液(0.2 mol/L，pH6.6)2.5 ml，铁氰化钾溶液(30mmol/L)2.5 ml，混匀，50 ℃水浴20 min，取出后迅速冷却至室温，再加入2.5 ml三氯乙酸(600 mmol/L)，混匀，离心(3000 r/min)10 min，取上清液2.5 ml，加超纯水2.5 ml，三氯化铁(6 mmol/L)0.5 ml，混匀，室温反应10 min，700 nm处测吸光度。注：用Vc作阳性对照，以1 ml无水乙醇代替样品作空白。所有测定平行3次，取平均值。

2 结果与分析

2.1内生真菌的分离纯化

对黄精根茎部位内生真菌进行分离，分离纯化获得内生真菌菌株HJG3。保存于泰山医学院药学院综合实验室。

2.2抗氧化活性实验

2.2.1DPPH自由基清除率 依据1.2.3.1方法，得到样品HJG3和阳性对照品(Vc、BHT)不同浓度下对DPPH自由基的清除率(E)，并以浓度(C)为横坐标，自由基清除率(E)为纵坐标，得到HJG3、Vc、BHT对DPPH自由基的清除效果曲线，见图1。从图1可见，HJG3粗提物在0.03125～64 mg/ml浓度范围内对DPPH自由基清除率与质量浓度呈良好量效关系。阳性对照Vc在0.125 mg/ml后对DPPH自由基清除率基本趋于稳定，BHT在 0.50 mg/ml后对DPPH自由基清除率基本趋于稳定，且Vc和BHT对DPPH自由基清除率均能达96%。可见，HJG3对DPPH自由基有一定的清除效果，但弱于Vc和BHT。根据图1，在有效浓度范围内，建立浓度C与自由基清除率E的线性关系，得回归方程，并计算 IC50(E为50%时的浓度)。结果见表2。

图1 HJG3、Vc和BHT对DPPH自由基的清除效果曲线

样品线性方程R2IC50值/mg·ml-1HJG3Y=2.4944X+15.0130.997114.0262VcY=1391X+5.89511.00000.0317BHTY=340.97X+0.43860.99990.1454

2.2.2铁氰化钾还原力的测定 依据 1.2.3.2方法，测定HJG3和阳性对照品(Vc 、BHT)不同浓度下在700 nm吸光度。并以浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标，得到HJG3、Vc、BHT还原力曲线，结果见图2。从图2可见，Vc在 0～0.25 mg/ml范围内，其吸光值随浓度增大不断增大；BHT在0～1.0 mg/ml范围内，其吸光值随浓度增大不断增大，在1.0～8.0 mg/ml范围内BHT吸光值略有下降趋势；HJG3在0～8.0 mg/ml范围内，其吸光值与浓度接近线性关系，在最高浓度8.0 mg/ml时，吸光值最大，还原力最强，但在相同浓度下，其还原力弱于Vc和BHT。

图2 HJG3、Vc 、BHT还原力曲线

依据图2，在有效浓度范围内建立浓度C与吸光度A的线性关系，得回归方程，并计算EC50(A 为 0.5 时的样品浓度)，结果见表3。

表3 HJG3、Vc和BHT还原力线性方程及EC50值

3 讨 论

本实验采用组织块分离法得到一株黄精内生真菌HJG3，并用DPPH法和铁氰化钾还原力法测定了HJG3乙酸乙酯粗提物的抗氧化活性。结果表明，黄精根茎中含有内生真菌，且HJG3粗提物有一定抗氧化活性，其抗氧化活性弱于阳性对照Vc和BHT。本实验仅对黄精内生真菌HJG3抗氧化活性进行了初步研究，希望能为黄精内生真菌相关研究和黄精的综合开发利用提供一定参考资料。

综上所述，黄精内生真菌 HJG3乙酸乙酯粗提物有一定抗氧化活性，但其抗氧化活性弱于Vc和BHT。

[1] 苗智,马养民,孔阳,等.夹竹桃内生真菌J14次生代谢产物的分离和抑菌活性[J]. 贵州农业科学,2016,44(1):88-92.

[2] 郭良栋.内生真菌研究进展[J].菌物系统，2001,20(1):148-152．

[3] 刘伟,倪辉,黄高凌,等.从红树植物中筛选具有抗菌、抗氧化和抗肿瘤活性的内生真菌[J]. 激光生物学报, 2012, 21(6):569-574.

[4] 刘雅莉,黄一泓,武文斌,等. 蒺藜内生真菌抗氧化活性菌株的筛选[J].天然产物研究与开发, 2013, 25:435-439.

[5] 赵玥,秦源,李娜,等.具有抗氧化活性的北五味子内生真菌的筛选及鉴定[J]. 中国药房, 2015, 26(31):4384-4387.

[6] 杜晓宁,代金霞.宁夏枸杞内生菌抗氧化活性菌株的筛选与鉴定[J].2015,40(20): 3941-3944.

[7] 王光辉,王琦,时元林.泰山四大名药 [J]. 山东中医杂志, 2006,25(3): 203-204.

[8] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典(一部)[M]. 北京:中国医药科技出版社, 2015:306-307.

[9] 王婷, 苗明三. 黄精的化学、药理及临床应用特点分析[J]. 河南中医学院学报, 2015, 30(5):714-715.

[10] 李艳玲, 王德才, 史仁玖, 等. 泰山黄精内生真菌的分离鉴定及抑菌活性研究[J]. 中草药,2013,44(11):1490-1492.

[11] 汪滢, 王国平, 王丽薇, 等. 一株多花黄精内生真菌的鉴别及其抗菌代谢产物[J]. 微生物学报,2010,50(8):1036 -1043.

[12] 毕江涛, 何萍, 吕雯，等. 桃儿七内生真菌分离及其抑菌活性初步研究[J]. 中草药,2013,43(12):1667-1672.

[13] 刘雷，潘峰，杨远兵，等. 川麦冬内生真菌分离和鉴定及抑菌活性初步研究[J].中草药,2016,47(8):1382-1391.

[14] 徐旭, 杨世林, 冯育林，等. 四叶参内生真菌 SYY1 抗氧化及抑菌活性的初步研究[J].江西中医药大学学报,2016,28(4):80-83.

[15] 钱一鑫, 康冀川, 雷帮星，等. 贵州白苞蒿抗肿瘤、抗氧化内生真菌的筛选与鉴定[J].中国中药杂志,2014,39(3):438-441.

Isolation of an endophytic fungus from polygonatum sibiricum and preliminary studies on its antioxidant

YANG Hong-yun HUANG Qiao-li LIU Zhen-liang LIU Xin-xin LU Yi CUI Meng SUN Li-yan

(Taishan Medical University, Taian 271016, China)

Objective:Endophytic fungi in medicinal plants produce a variety of bioactivity compound.In this study, endophytic fungi were isolated from rhizoma of Polygonatum sibiricum, of which the antioxidant activity was studied. Methods:The cultural method of plant tissue paster on solid medium was used for isolating endophytic fungus from rhizoma of Polygonatum sibiricum.DPPH method and Potassium ferricyanide reduction force measurement were used for the determination of antioxidant activity of endophytic fungus HJG3 crude extrat. Results:One strain of endophytic fungus HJG3 was obtained from rhizoma of Polygonatum sibiricum. In the tested concentration range of HJG3 crude extract, the scavenging DPPH ability and the reducing power of endophytic fungus HJG3 had obvious dose-effect relationships with the concentration. The IC50was 14.0262 mg/ml, EC50was 1.8475 mg/ml.Conclusions:There were endophytic fungi in Polygonatum sibiricum. The crude extract of endophytic fungus HJG3 from Polygonatum sibiricum had certain antioxidant activity, which could be used as the potential resource for screening natural bioactivity constituents.

polygonatum sibiricum;endophytic fungi;antioxidant activity

山东省自然科学基金项目(ZR2011CQ011)；泰安市科学技术局项目(2015NS2123)；泰医高层次培育课题(2015GCC14)；国家级大学生创新创业训练计划(201510439014，201510439083)。

杨洪芸(1992—)，女，中药学专业2013级本科生。黄巧丽，女，生药学专业2016级硕士生，并列第一作者。

崔萌，E-mail: 15698122269@163.com。孙立彦，硕士生导师，E-mail: hhhyyy1982@163.com。

R285

A

1004-7115(2017)10-1081-03

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.10.001

2017-07-23)