HPLC在百草枯浓度检测中的应用研究

杨京霞，隋娟娟，姬云涛

（1.阜阳师范学院 生物与食品工程学院，安徽 阜阳 236037；2.安徽省抗衰老中草药安徽省工程技术研究中心，安徽 阜阳 236037；）

HPLC在百草枯浓度检测中的应用研究

杨京霞1,2，隋娟娟1，姬云涛1

（1.阜阳师范学院 生物与食品工程学院，安徽 阜阳 236037；2.安徽省抗衰老中草药安徽省工程技术研究中心，安徽 阜阳 236037；）

建立一种快速检测病人血清中百草枯浓度的方法。本文采用乙腈沉淀血液中蛋白，色谱柱为岛津vp-ODS柱，以乙腈-0.02 mol/L辛烷基磺酸钠（4∶6）为流动相，流速1.0 mL/min，PDA检测器，检测波长为258 nm，柱温25℃。结果是在0.1～100 μg/mL范围内线性关系良好（r=0.999 3）；回收率为94.87%～105.51%；精密度RSD值为3.08%，重复性RSD值为2.26%。以该色谱条件对某患者的血清进行检测，外标法计算得血清中百草枯浓度为5.91 μg/mL。实验证明本方法蛋白沉淀完全，没有杂质峰干扰，出峰时间较早，灵敏度高，可快速检测病人血清中百草枯浓度，为临床治疗提供参考。

HPLC法；血清；百草枯浓度

百草枯（PQ），又名克无踪、对草快，为快速触杀型季胺盐类除草剂，对人、畜都有较强的毒性，可经口服、皮肤渗透等被吸收，造成急性中毒。由于目前还没有特效的解毒剂，中毒后死亡率较高[1-2]，并且PQ在中毒患者血清中的浓度与死亡率密切相关，因此对病人血清中百草枯浓度的检测对临床治疗十分重要。目前其检测方法多为气质联用法[3]、毛细管电泳法[4-6]、分光光度法[7]等，但这些方法有的仪器昂贵如液相串联质谱法[8]，有的样品制备过程比较繁琐如固液萃取[9-11]，还有的回收率较低（如低、中、高3种浓度的加样回收率分别为90.5%、91.5%、87.4%），相对标准偏差稍高（5%～10%）等[8]。本实验中采用乙腈去蛋白法离心后取病人血清，建立高效液相色谱法（HPLC）检测病人血清中PQ浓度，该方法能快速准确的测定病人血清中百草枯浓度，准确性和灵敏度也相对较高，可以为临床百草枯中毒患者的血清浓度进行检测，为评估中毒情况和临床治疗提供条件依据。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津），SIL-20A自动进样器，SPD-M20A检测器；MiniSpin(R)plus个人型高速离心机，真空抽滤泵等。

1.2 试剂

PQ标准品（青岛丰邦农化有限公司，20140414），辛烷基磺酸钠，磷酸，乙腈（色谱纯），高氯酸，三氯甲烷，离子水。

2 实验方法

2.1 色谱条件

色谱柱为岛津VP-ODS柱（4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为乙腈-0.02 mol/L辛烷基磺酸钠缓冲液(4∶6)，用 0.26 mol/L磷酸调 pH值为 2.5；流速1.0 mL/min；检测波长258 nm；柱温：25℃。

2.2 对照品溶液的配制

准确量取百草枯标准品于容量瓶中，用去离子水稀释成100 μg/mL溶液，置于4℃冰箱保存备用。

2.3 病人血样的制备

将病人血样置于4℃冰箱中，30 min后精密吸取析出的血清200 μL于离心管中，加入乙腈400 μL，涡旋混合 1 min，3500 rpm 离心 10 min，取上清液，然后10 000 rpm离心10 min，取上清液100 μL放入进样瓶，按2.1色谱条件进样分析，测其峰面积。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察

用健康人血按2.3节样品处理的方法得到血清，分别配制 0.1、0.2、0.5、1、2.5、5、10、25、50 μg/mL的百草枯含药血清溶液，进样量为2 μL，按2.1色谱条件进样分析测其峰面积。以百草枯浓度（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，进行线性回归，得到PQ的回归方程为y=6 560.7x－4 577.3，r=0.999 3。

2.4.2 回收率试验

配制低、中、高三种浓度（5 μg/mL、10 μg/mL、25 μg/mL)的PQ标准血样各5份，按2.3样品制备方法处理后进样分析，分别测定各浓度下样品的平均峰面积，将所得数值带入标准曲线，计算实际浓度，并与理论浓度相比计算PQ的回收率分别为94.87%、95.79%、105.51%。

2.4.3 精密度试验

配制已知浓度（10 μg/mL）的PQ血清样品5份，按2.3样品制备方法处理后进样分析，测得该浓度下的峰面积的RSD值为3.08%，表明该方法的精密度较高。

2.4.4 重复性试验

配制已知浓度（10 μg/mL）的PQ血清样品5份，3 d内连续进样，测得峰面积的RSD值为2.26%，结果表明该方法的重复性较好。

2.4.5 稳定性试验

配制已知浓度（10 μg/mL）的PQ血清样品，按样品处理方法处理进样，测得峰面积，考察室温放置24 h、48 h的稳定性，结果测得峰面积的RSD值为1.47%，说明室温条件下百草枯比较稳定。

3 样品分析结果

采集患者王某静脉血,按血清样品制备方法进行处理，进样分析，检测出的峰面积为47 826，百草枯对照品（100 μg/mL）峰面积平均值（n≥5）为809 727，以外标法计算病人血清中百草枯的浓度为 5.91 μg/mL，色谱结果如图 1～2。

4 讨论

4.1 样品处理方法的讨论

在本实验样品处理过程中，先后采用四种不同的方法进行蛋白沉淀，分别是方法一：用30%高氯酸和三氯甲烷沉淀蛋白，4 000 rpm离心后取上清进样。方法二：30%高氯酸沉淀蛋白，混旋2min后置于4℃冰箱中保存10 min，12 000 rpm下离心后取上清进样。方法三：方法二中得到的上清液再加入30%高氯酸，离心后取上清液进样分析。方法四：加入乙腈沉淀蛋白，涡旋混匀，离心后取上清液进样分析。四种方法所得的色谱图见图3～6。结果可知用乙腈做为蛋白沉淀试剂，可使蛋白沉淀完全，在检测中未有干扰组分，血样中的内含物质与百草枯分离完全，且峰型较好，所以最终确定乙腈沉淀蛋白。

图1 百草枯标准溶液色谱图

图2 待测病人血清色谱图

图3 方法一病人血清色谱图

图4 方法二病人血清色谱图

图5 方法三病人血清色谱图

图6 方法四病人血清色谱图

4.2 百草枯在全血和血清中含量的讨论

本实验研究了百草枯在健康人全血和血清中的浓度差异，实验结果表明将已知浓度的百草枯加入健康人血液按2.3节处理后进样分析和取健康人血清直接加入已知浓度的百草枯后进样分析，所得结果存在明显差异，大量实验数据表明差值范围在27%～31%，说明在样品处理过程中百草枯有一定损失，在实际应用中应该把这种损失考虑在内。由已检测140多名患者可知，病人血清百草枯浓度多集中在0.2～5.0 μg/mL。因此，确定的标准曲线范围0.1～100 μg/mL较符合临床实际。

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Detection of paraquat concentration using high performance liquid Chromatography

YANG Jing-xia1,2,SUI Juan-juan1,JI Yun-tao1

(1.School of Biological and Food Engineering,Fuyang Normal University,Fuyang,Anhui,236037,China;2.Engineering Technology Research Center of Anti-aging Chinese Herbal Medicine of Anhui Province,Fuyang Anhui 236037,China)

To establish a rapid method for the determination of paraquat in patient's serum,this analysis used acetonitrile to precipitate protein in the blood and conducted on a vp-ODS column.The mobile phase consists of acetonitrile-0.02 mol/L symplectic alkyl sulfonate(4∶6),and the flow rate is 1.0 mL/min.The analysis used PDA detector,and the detection wavelength was 258 nm and the column temperature was 25 ℃.The results were a good linearity in the rage of 0.1～100 μg/mL(r=0.999 3);The recovery ratio was 94.87%～105.51%;Precision RSD value was 3.08%,the repeatability RSD value was 2.26%.In the chromatographic conditions for some of patient’s serum detection,the external standard method for calculating the concentration of serum paraquat was 5.91 μg/mL.Conclusions:The method of protein precipitate is complete,without impurity peak,with an earlier peak time and high sensitivity,which can quickly detect patients with paraquat concentration in serum,and provide reference for clinical treatment.

HPLC;serum;paraquat concentration

R917

A

1004-4329（2017）02-042-04

10.14096/j.cnki.cn34-1069/n/1004-4329（2017）02-042-04

2016-12-21

国家自然科学基金青年项目（31201788）；安徽省教育厅自然科学研究重点项目（KJ2016A872）；安徽省科技计划项目（1704g07020112）资助。

杨京霞(1982－ )，女，硕士，讲师，研究方向：中药成分分析及活性。