槲皮素改善高糖损伤大鼠冠脉肌原性反应的机制研究*

侯晓敏， 张明升， 赵良渊， 齐鼎铭， 秦小江△

(山西医科大学 1基础医学院， 2公共卫生学院， 山西 太原 030001)

槲皮素改善高糖损伤大鼠冠脉肌原性反应的机制研究*

侯晓敏1， 张明升1， 赵良渊2， 齐鼎铭1， 秦小江2△

(山西医科大学1基础医学院，2公共卫生学院， 山西 太原 030001)

目的通过大鼠冠状动脉(coronary artery，CA)张力测定和全细胞膜片钳记录CA血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)的电压门控性钾通道(voltage-gated K+channel， Kv)电流，研究槲皮素改善高糖损伤大鼠CA肌原性反应的机制。方法从正常SD大鼠急性分离得到CA环，然后分成6组：(1)正常对照组；(2)高糖组；(3)高糖+低剂量(3 μmol/L)槲皮素组;(4)高糖+中剂量(10 μmol/L)槲皮素组;(5)高糖+高剂量(30 μmol/L)槲皮素组;(6)高糖+蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)抑制剂C6303+高剂量槲皮素组。利用血管张力测定，检测CA环对血管收缩剂(60 mmol/L KCl和0.1 mmol/L U46619)的反应，并将CA环用60 mmol/L KCl预收缩后，用乙酰胆碱(acetylcholine，ACh； 10-9～10-5mol/L)进行舒张，计算ACh引起CA 环张力下降幅度与预先收缩的百分比。急性分离得到大鼠CA的VSMC，然后记录Kv电流。结果与正常対照组相比，高糖组CA环对60 mmol/L KCl和0.1 mmol/L U46619的反应明显升高；中、高剂量槲皮素的干预可以使高糖所致CA环对血管收缩剂的反应降低，孵育PKC特异性抑制剂C6303可减弱槲皮素的作用。与正常对照组相比，高糖组大鼠离体CA环对ACh的舒张幅度明显减弱。槲皮素的干预可以改善高糖孵育的大鼠离体CA环对ACh的舒张反应，C6303可以减弱槲皮素的作用。高糖孵育明显抑制CA VSMC的Kv电流，槲皮素干预可以减弱高糖对CA VSMC Kv电流的影响，孵育C6303可减弱槲皮素的作用。结论槲皮素对高糖损伤大鼠CA肌原性反应具有保护作用，该作用与增大VSMC的Kv电流和激活PKC有关。

槲皮素； 冠状动脉； 高糖； 电压门控性钾通道； 蛋白激酶C

糖尿病损伤血管的基础致病原因为高浓度葡萄糖损伤血管细胞，其中高血糖对冠状动脉(coronary artery，CA)损害引发的冠心病为其致死的首要原因。而且高血糖可以损伤CA血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)上的某些离子通道，如电压门控性钾通道(voltage-gated K+channels，Kv)[1]。

Kv是动脉VSMC上表达最多的钾离子通道[2]。CA给心肌细胞提供养分，其管壁主要是VSMC。有研究报道，Kv对调节CA肌张力非常重要[3]。

槲皮素(quercetin，Que)是一种典型的黄酮类化合物[4]，其生物学作用极其广泛，能够降低血脂水平[5]、拮抗心肌缺氧-复氧损伤[6]、抑制心肌细胞肥大[7]等。本课题组前期研究显示，槲皮素可降低大鼠CA张力，该作用与增大CA VSMC的Kv电流有相关性[8]。据报道，膳食中增加一定量的槲皮素，不仅可以降低糖尿病大鼠血糖水平[9]，还可以降低糖尿病相关心血管疾病的风险[10]，然而关于槲皮素对高糖损伤大鼠的CA有何影响尚未见报道。

鉴于高浓度葡萄糖能够通过抑制CA VSMC的Kv引起大鼠CA损伤，而槲皮素舒张大鼠CA又与增大CA VSMC的Kv电流有关，我们提出科学假设——槲皮素能够通过改善Kv功能减轻高糖所致CA肌原性反应障碍。而且最近有相关研究表明，蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)是调节 Kv 功能和表达的重要中介[11]，基于此，本项目将进一步通过应用PKC抑制剂C6303探讨槲皮素作用的相关机制。

材 料 和 方 法

1动物

实验所用健康SD大鼠购于山西医科大学动物中心，合格证编号：SCXY(晋)2015-0001。

2实验试剂

槲皮素、C6303和HEPES(Sigma)；其余试剂均购自北辰方正试剂公司。

3方法

3.1实验分组 从正常大鼠心脏急性分离得到CA环，首先利用血管张力记录仪验证其活性，选取对血管收缩剂反应良好的CA环用于高糖(high glucose，HG；25 mmol/L)孵育CA环实验。整个实验中保证CA环浸润于37 ℃、O2饱和HEPES缓冲液中，实验分组如下(每组6根CA环，且每根血管分别来源于不同大鼠)：(1)正常对照(control)组：正常HEPES液，葡萄糖终浓度为5.5 mmol/L；(2)HG组：HEPES 液，葡萄糖终浓度为25 mmol/L；(3)HG+低剂量Que组： 低剂量(3 μmol/L)Que预处理CA环后，浸润于高糖(25 mmol/L) HEPES液中；(4)HG+中剂量Que组：中剂量(10 μmol/L)Que预处理CA环后，浸润于高糖(25 mmol/L)HEPES液中；(5)HG+高剂量Que组：高剂量(30 μmol/L)Que预处理CA环后，浸润于高糖(25 mmol/L)HEPES液中；(6)HG+C6303+高剂量Que组：依次用PKC抑制剂C6303(1 μmol/L)和Que(30 μmol/L)预处理CA环后，浸润于高糖(25 mmol/L)HEPES液中。

3.2离体CA环张力测定 参照本课题组前期实验方法[8]，通过血管张力记录仪测定CA环张力。记录各组大鼠CA环对收缩剂(60 mmol/L KCl或0.1 mmol/L U46619)的反应，以及将CA环用KCl预收缩后，观察其对血管舒张剂[乙酰胆碱(acetylcho-line，ACh)；10-9～10-5mol/L]的舒张反应。

3.3膜片钳记录大鼠CA VSMC的Kv电流 本部分实验方法同本课题组前期研究[8]，选取Que的实验剂量为30 μmol/L，分组处理CA环后，急性分离得到大鼠CA的VSMC，然后以全细胞膜片钳记录各组大鼠CA VSMC的Kv电流，从-60 mV开始，一直刺激到+60 mV，计算最后50 ms的电流平均值，用细胞的电容标化其电流，得到电流密度值，并绘制I-V曲线。

4统计学处理

统计分析采用SPSS 18.0软件进行，应用Graph-Prism 6.01作图。实验数据以均数±标准差(mean±SD)表示，各组数据进行单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1各组大鼠CA环对血管收缩剂的反应

正常对照组CA环对60 mmol/L KCl和0.1 mmol/L U46619的收缩幅度分别为(3.1±0.4) mN和(3.6±0.3) mN；高糖孵育大鼠离体CA环48 h后，CA环对60 mmol/L KCl的收缩幅度增加到(5.0±0.3) mN，对0.1 mmol/L U46619的最大收缩幅度增加到(5.3±0.4) mN；中、高剂量槲皮素的干预可以降低高糖所致CA环对KCl和U46619的收缩反应；C6303可以减弱槲皮素的作用，见图1。

Figure 1. The contraction amplitude of CA ring to KCl or U46619. Mean±SD.n=6 .**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsHG；△P<0.05vsHG+Que (30 μmol/L).

图1CA对血管收缩剂的收缩反应

2各组大鼠CA环对血管舒张剂的反应

正常对照组大鼠CA环对ACh的舒张最大百分比为(70.1±3.1)%，而高糖孵育大鼠离体CA环48 h后，CA环对ACh的舒张反应与对照组相比显著降低(P<0.01)。槲皮素的干预可以改善高糖孵育大鼠离体CA环对ACh的舒张反应(P<0.05)；C6303可以减弱槲皮素的作用(P<0.01)，见图2。

Figure 2. The diastolic reaction of CA ring to ACh. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsHG;△△P<0.01vsHG+Que (30 μmol/L).

图2CA对ACh的舒张反应

3各组大鼠CAVSMC的Kv电流

正常対照组在+60 mV时CA VSMC的Kv电流密度为(53.41±3.25) pA/pF，高糖孵育明显抑制大鼠CA VSMC的Kv电流，其在+60 mV时CA VSMC的Kv电流密度为(23.52±2.24) pA/pF；高剂量(30 μmol/L)槲皮素干预可以削弱高糖对CA VSMC Kv电流的影响；C6303可减弱槲皮素的作用，见图3。

Figure 3. The Kv current density of CA VSMC. A: theI-Vcurve of Kv current density; B: the Kv currents evoked by a test pulse at +60 mV. Mean±SD.n=6 .**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsHG；△P<0.05vsHG+Que (30 μmol/L).

图3膜片钳记录CAVSMC的Kv电流

讨 论

据报道，高糖可以使血管对许多血管活性物质的反应发生改变[12-13]。本实验中我们通过观察离体大鼠CA对血管收缩剂和舒张剂的反应发现，空白对照组中CA环对KCl和U46619的收缩幅度分别为(3.1±0.4)mN和(3.6±0.3)mN，高糖孵育大鼠离体CA血管环48 h后，其CA环的肌原性反应发生了明显变化，对血管收缩剂的收缩反应显著提高，其最大收缩幅度分别上升为(5.0±0.3) mN和(5.3±0.4) mN，而对ACh的舒张反应却明显减弱。这提示我们，高糖孵育对CA环的内皮造成了一定程度的损伤。而中、高剂量的槲皮素干预后，其上述变化得到了一定程度的改善，说明槲皮素对CA环的内皮具有一定程度的保护作用。

有研究报道，Kv开放可舒张动脉平滑肌[3, 14]，Kv 在调节CA肌张力方面起关键作用[3]。本实验中高糖孵育大鼠CA环48 h后，急性分离得到CA的VSMC，用全细胞膜片钳记录CA VAMC Kv电流发现，与正常对照组相比，高糖组Kv电流显著降低，其在+60 mV处的电流密度由(53.41±3.25) pA/pF降低至(23.52±2.24) pA/pF，而高剂量槲皮素干预削弱了高糖组CA VSMC Kv电流的下降幅度。

为了进一步探讨槲皮素对高糖孵育CA环肌原性反应改变与PKC的关系，在实验设计中我们应用了PKC特异性抑制剂C6303，发现该抑制剂的使用可部分逆转槲皮素前述作用，这些结果均提示槲皮素对高糖所致CA环肌原性反应改变与激活PKC有关。

综上所述，槲皮素可改善高糖损伤的大鼠CA肌原性反应，该作用与增大VSMC的Kv电流和激活PKC有关。

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(责任编辑： 卢 萍， 余小慧)

鉴定T细胞受体谱系中的特异性组

T细胞受体(T-cell receptor, TCR)的序列非常多样，比任何一个个体的T细胞有更多的可能序列组合。来自斯坦福大学医学院的Glanville等采用肽和主要组织相容性复合体(peptide and major histocompatibility complex, pMHC)-四聚体(tetramer)分选的一组细胞和结构化数据来分析TCR序列，从而确定了TCR抗原特异性的最小要求。他们从这个分析中开发了一个算法，称为GLIPH(grouping of lymphocyte interactions by paratope hotspots，通过互补位热点的淋巴细胞相互作用分组)。他们用这个算法来聚类TCRs。由于保守基序的存在和互补性决定区3(complementarity-determining region 3, CDR3)序列的全局相似性，此方法的共享特异性(sharing specificity)概率很高。他们发现，GLIPH能够可靠地将来自不同供体而具有共同特异性(common specificity)的TCR进行分组，并且保守的CDR3基序有助于确定作为抗原肽经常接触点(often contact points)的TCR簇。他们从具有潜在结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)感染的22个个体的反应性CD4+T细胞中分析了5 711个TCRβ链序列，作为独立验证实验。他们发现了141个TCR特异性组，包括16个不同的组，其中含有来自多个个体的TCR。这些TCR组通常共享HLA等位基因，可用于预测可能的HLA限制，并且大量结核分枝杆菌T细胞表位使得他们能够鉴定所有五个测试组的pMHC配体。诱变(mutagenesis)和从头TCR设计证实，GLIPH所鉴定的基序具有关键性，足够用于共享抗原识别(shared-antigen recognition)。因此，GLIPH算法可以分析大量的TCR序列，并确定TCRs和个体共享的TCR特异性组，这大大加快了T细胞应答的分析和特异性配体的鉴定。

Nature, 2017, 547(7661):94-98(李肖肖)

Mechanismofquercetinimprovingratcoronaryarterymyogenicresponseunderhighglucose

HOU Xiao-min1, ZHANG Ming-sheng1, ZHAO Liang-yuan2, QI Ding-ming1, QIN Xiao-jiang2

(1SchoolofBasicMedicalSciences，2SchoolofPublicHealth,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China.E-mail:sxykdxyxy@163.com)

AIM: To investigate the mechanism of quercetin improving rat coronary artery myogenic response under high glucose (HG) by measuring muscle tension of coronary arterial ring and recording voltage-gated K+channel (Kv) current of coronary artery smooth muscle cells by whole cell patch clamp.METHODSThe coronary rings from the normal SD rats were acutely isolated, and then divided into 6 groups: (1) control group; (2) HG group; (3) HG+low dose (3 μmol/L) of quercetin group; (4) HG+moderate dose (10 μmol/L) of quercetin group; (5) HG+high dose (30 μmol/L) of quercetin group; (6) HG+C6303 (PKC inhibitor)+high dose of quercetin group. Determinations of coronary artery response to vasoconstrictor (60 mmol/L KCl or 0.1 mmol/L U46619) or vasodilator (ACh at 10-9～10-5mol/L) were performed, and the percentage of coronary ring tension was calculated using the contraction as 100% caused by 60 mmol/L KCl. The rat coronary artery smooth muscle cells were acutely isolated for recording the Kv current using whole cell patch clamp.RESULTSCompared with control group, the contraction amplitudes to 60 mmol/L KCl or 0.1 mmol/L U46619 were significantly increased under HG incubation. Quercetin intervention concentration-dependently reduced the coronary artery contraction amplitude. Incubation of PKC specific inhibitor C6303 attenuated the effect of quercetin. Compared with control group, the diastolic amplitude to ACh decreased significantly in HG group, and quercetin intervention concentration-dependently increased the coronary artery diastolic amplitude. Incubation of PKC specific inhibitor C6303 attenuated the effect of quercetin. Compared with control group, HG incubation inhibited Kv current of coronary artery vascular smooth muscle cells significantly, and quercetin intervention attenuated the inhibitory effect of HG on Kv current intensity. Incubation of PKC specific inhibitor C6303 attenuated the effect of quercetin.CONCLUSIONQuercetin has a protective effect on myogenic response of coronary artery under HG and the effects is related to the increase in Kv current and the activation of PKC in vascular smooth muscle cells.

Quercetin; Coronary artery; High glucose; Voltage gated K+channels; Protein kinase C

R587.1; R541.4

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.10.011

1000- 4718(2017)10- 1801- 05

2017- 04- 06

2017- 07- 07

山西医科大学博士启动基金(No. 03201510； No. 03201521)；山西省高等学校科技创新项目(No. 2017146； No. 2017147)；山西省青年科技研究基金(No. 201701D221247； No. 201701D221259)； 山西医科大学青年基金(No. 02201604； No. 02201613)

△通讯作者 Tel: 0351-4639120； E-mail: sxykdxyxy@163.com

杂志网址： http://www.cjpp.net