甲酚紫类光学探针的研究进展

张昊琳， 胡一鸣， 马会民

(活体分析化学重点实验室，中国科学院化学研究所,北京 100190)

1 引言

光学探针是指与分析物发生特异性反应并引起吸光、荧光或发光等光学性质的变化，且基于这些光信号的变化对分析物进行分析测定的一类试剂[1]。其中，基于荧光探针的分析方法由于具有高时空分辨率、高灵敏度与无损检测等优势，被广泛用于生物体系中相关物质的检测。另外，与现代成像技术相结合，还可对分析物的分布情况与变化趋势进行分析[1 - 2]。甲酚紫是一种性能优良的长波长荧光母体，并具有量子产率高、稳定性好和不易光漂白等优点，特别是其9-位的氨基易发生取代作用并导致荧光猝灭或波长漂移，而取代基的去除则又可将甲酚紫的氨基释放出来，荧光得以恢复。因此，该荧光母体已成为设计打开型和比率型光学探针的有效分子平台[3]。此外，甲酚紫通常带有正电荷，可通过静电引力与某些特定的纳米材料相结合，并以此发展不同功能的纳米光学探针。

本文结合我们实验室在甲酚紫类光学探针方面的研究工作，首先介绍甲酚紫的性质，包括商品化的甲酚紫中常见但却尚未引起重视的一种与甲酚紫结构相似的杂质[3]，然后重点评述甲酚紫分别在蛋白酶、小分子与pH光学探针设计与分析应用方面的新进展，并展望甲酚紫类光学探针的发展前景。

2 甲酚紫的性质

甲酚紫又名甲酚青莲，属恶嗪类染料，其乙酸盐结构式见图1。甲酚紫具有较强的组织穿透能力与良好的生物相容性，常用作动物实验中神经细胞的染色剂[4 - 6]。随着激光技术的提出与应用，甲酚紫、吖啶红、罗丹明B、罗丹明6G、香豆素等有机激光染料也随之发展起来；在这个过程中，甲酚紫的光学性质得到了进一步的研究[7 - 11]。甲酚紫水溶液呈紫色，其最大吸收和发射波长分别为585 nm和625 nm，可避免生物体系中短波长背景荧光的干扰[3]。此外，甲酚紫具有较高的荧光量子产率(量子产率=0.51)和良好的化学与光稳定性，且光学性质不受常见生物物质的干扰。我们还考察了甲酚紫本身荧光强度随溶液pH的变化情况。由图2可见，甲酚紫在弱酸性溶液，如pH=4.5～5.5中具有强荧光；虽然在生理pH范围(pH=7～8)内荧光略有降低，但仍较强，且此荧光几乎不受生理pH变化的影响。重要的是与试卤灵荧光体的羟基取代反应类似[12]，甲酚紫9-位氨基的取代反应通常也会导致荧光猝灭或波长漂移，而取代基发生反应脱去后，甲酚紫荧光母体被释放出来，荧光也随之恢复[3,13]。利用这一特性，人们通过在9-位氨基上设置不同的识别单元(图1)，设计合成了一系列新的甲酚紫类打开型和比率型光学探针，并用于不同生物分子的检测与荧光成像分析。此外，人们利用带正电荷的甲酚紫及其衍生物与纳米材料间的静电吸附作用，发展了不同的纳米光学探针，也获得了良好的应用。

图2 甲酚紫(10 μmol/L)的荧光随溶液pH的变化情况(λex/λem=585/625 nm;20 mmol/L的不同pH磷酸盐缓冲液)Fig.2 Effect of pH on the fluorescence of cresyl violet(10 μmol/L) in 20 mmol/L phosphate buffer with different pH

需要指出的是，商品化的甲酚紫染料中常常存在一种杂质(图1)，其结构、性质与甲酚紫有一定相似性。我们曾对该杂质(为淡紫色固体)进行了分离，并研究了其结构与光学性质[3]。如图1所示，该杂质分子式为C16H11N2O2，分子量为262.08，9-位也存在一个活性氨基，但其溶液的颜色呈粉红色，主要吸收峰位于520 nm处，最大发射波长为615 nm，荧光量子产率略低于甲酚紫。研究表明，该杂质易发生光漂白，稳定性不如甲酚紫高，所以并不适合用作荧光基团。然而，值得注意的是，甲酚紫的阳离子结构其分子式为C16H12N3O+，分子量为262.10，与杂质的分子量十分相近。因此，若对混有杂质的甲酚紫进行氨基衍生反应，所得到的产物其分子量也非常相近，极易混淆。因此，必要时可采用二氯甲烷/甲醇(50/1，V/V)作为洗脱液，对甲酚紫原料进行纯化[3]。

3 甲酚紫类光学探针的应用

3.1 检测蛋白酶活性的甲酚紫类光学探针

近年，人们将不同酶的识别基团引入甲酚紫荧光体9-位的氨基，设计合成了一系列甲酚紫类荧光探针，用于硝基还原酶、谷胱甘肽转移酶、γ-谷氨酰转肽酶、焦谷氨酸肽酶1、二肽基肽酶4、亮氨酸氨肽酶、丙氨酸氨肽酶、透明质酸酶等的检测。以下对此作简要介绍。

图3 探针1的合成及其与硝基还原酶的反应Fig.3 Synthesis of probe 1 and its reaction with nitroreductase

硝基还原酶(Nitroreductase)是人体中一种重要的黄素酶，经常出现在缺氧的细胞中，并可在辅酶还原型烟酰胺腺嘌呤的存在下，有效地将芳香化合物中的硝基还原为羟胺或氨基。基于此特性，Ma等[14]以甲酚紫为母体一步合成了检测硝基还原酶的光学探针1(图3)，该合成方法简单，可操作性强。由于硝基的荧光猝灭作用，探针本身几乎无荧光(量子产率<0.01)，而在还原型烟酰胺腺嘌呤存在下，硝基还原酶可将探针上的硝基还原为氨基，释放出甲酚紫荧光体，导致反应体系625 nm处的荧光强度大幅增强。探针1对于硝基还原酶的检出限为1 ng/mL，可灵敏检测细胞中的硝基还原酶变化，并应用于细胞中的缺氧程度的监测。此外，该探针还具有较低的细胞毒性、良好的细胞渗透性；通过与荧光成像技术的联用，该探针已用于斑马鱼体内的硝基还原酶的分布检测，揭示了硝基还原酶可能主要存在于斑马鱼的卵黄囊部位。

谷胱甘肽转移酶(Glutathione Transferases)在某些肿瘤中呈现高表达。通过对谷胱甘肽转移酶的检测，可实现特定的肿瘤细胞的定位。Abe等[15]将亲电的磺酰胺基与甲酚紫的氨基相连，合成了两种性能优良的荧光探针2和3(图4)。探针本身没有荧光，但与谷胱甘肽转移酶反应后，磺胺键发生断裂，甲酚紫荧光体被释放出来，荧光也得以恢复。其中，探针2的适用范围尤其广泛，几乎适用于所有种类谷胱甘肽转移酶的检测，并已成功应用于细胞提取物以及活细胞中谷胱甘肽转移酶的检测与成像分析。

图4 探针2和3与谷胱甘肽转移酶的反应Fig.4 Reaction of probes 1 and 2 with glutathione transferases

γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyl Transpeptidase)是在谷氨酸循环中起关键作用的酶之一。人血清中γ-谷氨酰转肽酶的含量是临床诊断肝脏类疾病的重要指标。而且，γ-谷氨酰转肽酶高表达于黑素瘤、卵巢瘤、乳腺癌、肝癌等多种癌细胞中。Ma等[16]利用γ-谷氨酰转肽酶对谷氨酸肽键的特异性切割作用，设计合成了高选择性荧光探针4(图5)。反应后，体系荧光强度增强约500倍，且多种生理物种(包括无机盐、氨基酸、葡萄糖、氧化性物种、还原性物种以及其它蛋白酶)对反应均无影响。另外，探针4具有较低的细胞毒性与良好的细胞膜穿透性，不仅适用于临床血清样品，也适用于细胞中γ-谷氨酰转肽酶的可视化检测。

图5 探针4与γ -谷氨酰转肽酶的反应Fig.5 Reaction of probe 4 with γ -glutamyl transpeptidase

焦谷氨酸肽酶1(Pyroglutamate Aminopeptidase 1,PGP-1)可特异性切割多肽或氨基酸与N-端焦谷氨酸残基之间的肽键。Ma等[17]据此特性，发展了探针5(图6),该探针与PGP-1反应30 min即可达到平衡，体系颜色由橘色变为紫色，且荧光强度大幅增强，适用于PGP-1的快速检测。探针5具有优良的选择性、较好的灵敏度与生物兼容性，可用于细胞中PGP-1分布情况与变化趋势的准确检测。例如，我们利用该探针揭示了PGP-1主要分布于细胞质中，且这一结果得到了免疫荧光方法的验证。

图6 探针5与焦谷氨酸肽酶1的反应Fig.6 Reaction of probe 5 with pyroglutamate aminopeptidase 1

图7 探针6和7分别与成纤维活化蛋白和二肽基肽酶4的反应Fig.7 Reactions of probes 6 and 7 with fibroblast activation protein and dipeptide peptidase Ⅳ

二肽基肽酶4(Dipeptide Peptidase IV,DPPIV)能水解多种蛋白质与多肽，并释放出其N-末端的二肽。成纤维细胞活化蛋白(Fibroblast Activation Protein,FAP)属于二肽基肽酶4的同工酶，也可水解蛋白质或多肽并释放二肽。FAP与DPPIV在癌细胞的增殖、变异或转移过程中常常具有协同作用。Ma等[18]以甲酚紫为荧光母体一步制备了探针6，并在探针6的基础上合成了探针7(图7)。探针6和7分别与FAP和DPPIV结合，释放出甲酚紫荧光体，导致荧光信号的由关到开。探针6和7在对分析物的特异性检测过程中互相不干扰，可同时用于细胞内FAP与DPPIV的成像，并发现了成纤维活化蛋白与二肽基肽酶4在癌细胞增殖过程中呈现相反的行为。

顺铂是临床应用较广的抗癌药物之一。然而，在使用过程中，癌细胞往往表现出抗药性，且不同的癌细胞表现出不同的抗药性。对此，我们选择亮氨酸氨肽酶(Leucine Aminopeptidase,LAP)为研究对象并开展了相关探索，因为该微量酶可出现于多种癌细胞中。通过在甲酚紫的9-位氨基引入亮氨酸氨肽酶的特异性识别基团L-亮氨酸，我们制备了一种新的LAP荧光打开型探针8(图8)[19]。该探针具有超高的灵敏度，检测限可达0.42 ng/mL。利用该探针并结合共聚焦荧光成像技术，我们发现了LAP含量较高的癌细胞对于顺铂药物具有更强的抗药性。此外，该探针还成功用于人肝脏微粒体中微量亮氨酸氨肽酶的检测。

丙氨酸氨肽酶(Alanyl Aminopeptidase)广泛存在于哺乳动物体内。人体尿液中丙氨酸氨肽酶的含量可作为某些肾脏类疾病的初步诊断指标。最近，Shi等[13]通过在甲酚紫9-位氨基上连接丙氨酸分子，合成了一种比率型荧光探针9(图8)。由于丙氨酸分子具有吸电子效应，使得甲酚紫内的电荷转移程度被弱化，伴随着探针的荧光发射波长蓝移至575 nm处。该探针与丙氨酸氨肽酶反应后释放出甲酚紫母体，导致626 nm处荧光恢复。该探针对丙氨酸氨肽酶的检测限低至33 pg/mL，可用于微量丙氨酸氨肽酶的检测。目前，该探针已用于稀释500倍的人体尿液中丙氨酸氨肽酶的检测。此外，由于肝癌细胞中的丙氨酸氨肽酶呈现高表达，因此，该探针还可用于肝癌细胞与正常细胞的区分。

图8 探针8与9的结构Fig.8 Structures of probes 8 and 9

图9 探针10与癌细胞内透明质酸酶的反应Fig.9 Reaction of probe 10 with hyaluronidase in tumor cell[20]

透明质酸受体(CD-44)对于透明质酸分子具有较高的亲和力，并且高表达于一些癌细胞膜。所以，透明质酸分子可通过与CD-44介导的内吞作用进入特定的癌细胞。利用这一性质，Ma等[20]在透明质酸分子上修饰甲酚紫荧光染料与光疗剂卟啉分子，再将其偶联到金纳米颗粒上，合成纳米探针10(图9)。金纳米颗粒具有较高的猝灭效率，猝灭了甲酚紫的荧光，导致探针10几乎没有荧光。探针10进入表面高表达CD-44的细胞内部后，透明质酸分子链中的醚键被透明质酸酶特异性切割，释放出甲酚紫与卟啉，引起了620 nm处荧光强度的增强；另一方面，在紫外光的照射下，进入细胞内部的卟啉分子释放出单线态氧(1O2)，具有杀死癌细胞的效果。值得注意的是，在紫外线照射下，光疗剂卟啉释放出的1O2对于透明质酸分子链上的醚键也存在切割作用，同样引起甲酚紫的释放。因此，探针10对于透明质酸酶与紫外灯照射存在双重开启的效果，可用于癌细胞的靶向成像及治疗。

3.2 检测小分子的甲酚紫类光学探针

三聚氰胺是一种含氮杂环的三嗪类衍生物，常被添加在奶制品中，以提高蛋白质的检测含量。长期食用这种奶制品会在人体的肾脏、膀胱等部位形成结石，对人体造成伤害。因此，三聚氰胺的检测具有重要实际意义。吕昌银等[21]基于三聚氰胺对甲酚紫高氯酸盐的共振荧光强度的抑制作用，建立了阻抑共振荧光测定三聚氰胺的分析方法，检出限为29 nmol/L，可用于奶粉样品中的三聚氰胺检测。

H2S为生物体中的第三种气体信号分子，在调节细胞生长、保护心血管系统以及抗氧化等方面具有重要作用。Ma等[22]利用H2S的强还原性，合成了比率型荧光探针11(图10)。H2S可以将探针上的吸电子叠氮基还原为氨基，并伴随着发射波长的显著红移。研究发现，620 nm与566 nm波长处荧光强度的比值与的H2S浓度呈现出良好的线性关系。而且，该探针具有很高的选择性，常见的生物物质对于探针荧光响应均无干扰。探针11已用于活细胞与斑马鱼中H2S的成像分析，揭示出细胞内的H2S本底浓度低于0.1 μmol/L。

图10 探针11的制备及其与硫化氢的反应Fig.10 Synthesis of probe 11 and its reaction with H2S

Duan等[23]还将探针11应用于哺乳动物细胞的标记与比率荧光成像。即，基于Cu(Ⅰ)催化炔烃与叠氮发生环加成反应的原理，在人的乳腺癌细胞上连接含炔键的物质，探针11上的叠氮基与细胞上的炔键发生加成反应，伴随着体系566 nm处的荧光强度的减弱与620 nm处荧光强度的增强，从而实现了对细胞的荧光标记(图11)。由于哺乳动物细胞中内源性的H2S浓度低于探针11的检测限[22 - 25]，所以痕量H2S的存在对于检测无显著影响。此外，因为许多生物大分子都能采用类似的手段引入炔烃，所以该方法具有良好的应用前景。

图11 探针11与被炔烃标记的细胞反应Fig.11 Reaction of probe 11 with alkyne-labeled cell[23]

Gomez-Hens等[26]将疏水的磁性纳米金颗粒与长波长的甲酚紫荧光体进行组装，制备了磁性脂质体，可用于辅酶Q10的检测。在检测过程中，磁性脂质体通过流动系统与外部电磁装置富集在检测器前，随后引入Triton X-100 和辅酶Q10使磁性脂质体溶解，释放出来的甲酚紫被氧化而导致荧光信号的降低，这种荧光降低程度与辅酶Q10的浓度相关，据此可对食物中的辅酶Q10进行检测。该方法已用于鱼、肉、蜂花粉、菜籽油等食物样品中辅酶Q10的分析。

3.3 检测pH的甲酚紫类光学探针

pH值在许多化学反应与生物活动中都发挥着至关重要的作用。近年来，如何实现不同生物体内pH的精确检测，引起了人们的广泛关注。特别是利用荧光参数的变化来表征pH值，不仅灵敏度高、操作模式缓和，而且还可实时检测细胞内pH的动态分布和区域变化，因此，荧光探针法具有突出的优势[27]。

图12 探针12的结构Fig.12 The structure of probe 12

Oliveira等[28]以维生素B6和甲酚紫为原料合成了pH探针12(图12)。探针12的水溶液在585 nm处的吸光度随着pH的降低而增大，颜色由浅紫色变为深紫色。这是因为甲酚紫类似于其它恶嗪类阳离子染料，在稀溶液中通常以单体形式存在，但在酸性或极性条件下易发生聚集，形成H-二聚体，并伴有光谱产生变化[29]；在pH=11时，由于该探针发生去质子化，可导致吸收光谱的蓝移。因此，探针12可用于碱性pH的灵敏检测。

溶酶体为真核细胞中的一种亚细胞器，呈现弱酸性，是细胞内吞作用最后一步的反应场所。不带电荷的中性形式甲酚紫是一种弱碱，倾向于与质子结合(图13)[22]。最近，Grinstein等[30]发现甲酚紫的这一性质可作为溶酶体的靶向探针，并用人类细胞、小鼠细胞等进行了演示。他们还发现，当pH由7.4升为11.1时，甲酚紫的水溶液在585 nm处的吸光度随着pH的增加而逐渐降低，并指出甲酚紫属于亲脂性的弱碱，在不带电荷的状态下穿过生物膜，随后在细胞内发生质子化，同时在酸性细胞器表面可逆地积聚。这一过程既不改变细胞器pH，也不破坏细胞内的pH缓冲容量。此外，还发现甲酚紫的荧光不受生物体系中Ca2+、Mg2+、K+、Na+等离子的影响。

图13 甲酚紫对pH的响应Fig.13 Response of cresyl violet to pH

最近，Zhao等[31]将甲酚紫与荧光黄两种荧光染料包裹在纳米脂质体内部，设计了一种直径大约为100 nm 的比率型pH荧光探针，并测定了细胞内的pH。在pH=5～8的范围内，探针在波长516 nm与630 nm处的荧光强度比值与pH的增加呈现良好的线性关系。该探针不仅具有较低的细胞毒性，还具有很好的稳定性，在60 d内荧光几乎不变。此外，细胞内的常见物种对于检测均无显著影响。利用该探针还研究与发现了1 μg/mL脂多糖治疗下的炎症MCF-7细胞pH值显著下降的现象。

4 结论

综上所述，甲酚紫是一种优良的荧光体，特别是其9-位氨基的取代或取代基的去除往往会引起荧光的猝灭或恢复，这些特性使得甲酚紫越来越受到人们的关注，并用于发展一系列新的甲酚紫类光学探针。预计甲酚紫类光学探针未来的研究方向可能是：(1)目前，甲酚紫的修饰多位于其9-位氨基，对其杂环上的中心氮原子进行化学修饰也可能构建出新的荧光探针；(2)甲酚紫与其它荧光体联用，可构筑对两种分析物同时检测的光学探针；(3)利用甲酚紫设计其它生物小分子的光学探针仍有发展的空间。总之，随着性能更加优良、制备更加简单的甲酚紫类光学探针的不断出现，而将这些新型探针应用于不同生物体系，将会揭示出更多的生物新现象。