胶体介孔二氧化硅增强抗癌药物治疗效果的研究

丁 洁， 周 乐， 黄国良

(1.广东医科大学中美联合肿瘤研究所，广东省医学分子诊断重点实验室，广东东莞，523808;2.广东医科大学药学院，广东东莞 523808)

胶体介孔SiO2(CMS)作为一种优良的无机纳米药物载体已被广泛应用于生物医学中，尤其适用于抗癌药物的负载。CMS相较于其他的有机或高分子聚合物载体，独特的物理化学稳定性和一系列有利的结构特性使其具备了构建智能给药系统(DDS)的能力[1 - 3]。具有中空和介孔结构的CMS可选择性容纳药物分子[4 - 5]。另外，CMS还可以根据实际需求调整尺寸以便于其在癌细胞中的有效聚集，以及通过实体瘤的高通透性和滞留效应(EPR effect)在活体的肿瘤部位沉积[6 - 8]。将官能团修饰在CMS表面通常有后嫁接法和共缩合法两种方法。与后嫁接法相比，共缩合法能根据投料时间和量的不同控制官能团修饰的位置。通过共缩合法可合成表面带氨基的CMS，使其带正电荷，用于负载带负电荷的抗癌药物[9]。

5F(Ent-11α-hydroxy-15-oxo-kaur-16-en-19-oic-acid)是从粤产草药半边旗(PterissemipinnataL，PsL)中分离提取制备的一个活性化合物。研究发现，无论是活体实验还是体外实验，5F均可抑制结肠癌、肝癌及肺癌等多种肿瘤细胞的生长[10 - 13]。5F的抗肿瘤效果曾与一个著名的、在美国及日本正在进行临床实验的抗癌新药7-羟基十字孢碱(7-hydroxystaurosporine，UCN-01)进行过比较[14 - 15]，UCN-01较其母体化合物十字孢碱在抑制蛋白激酶C活性方面更具特异性。结果证实，5F可通过与UCN-01类似的方式诱导肿瘤细胞发生凋亡，且作用更强，30 nmol/L的5F即可达到100 nmol/L UCN-01对肿瘤细胞的抑制效果，两者诱导肿瘤细胞发生凋亡的水平相似，产生的时间过程曲线也相似[16]。但与其他抗癌药物类似，5F也有半衰期，这大大缩短了其在活体内循环的时间，还未起到完全的治疗作用即被代谢出体外[17 - 18]。

本文通过体外细胞实验研究了5F抑制鼻咽癌细胞生长的情况，设计了增强5F药效的药物载体胶体介孔SiO2(CMS)，借助该载体稳定了5F的分子结构，延长了5F的半衰期，提高了5F对肿瘤细胞的抑制效果。该设计具有普适性，在抗癌药物携带和肿瘤治疗方面具有广阔的应用前景。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

CMS的形貌通过JEOL-2010透射电镜(TEM)在加速电压200 kV下获得。Nanodrop-2000C紫外-可见分光光度计在242 nm处测量吸收强度换算5F的浓度。TCS SP5 共聚焦激光显微镜(Leica,Germany)进行共聚焦成像。全波长扫描式多功能读数仪(Thermo Fisher Scientific，Varioskan Flash)读取细胞经CCK-8孵育后的吸光度，计算细胞活性。

(3-氨丙基)三乙氧基硅烷(APTES)、三乙醇胺(TEA)、正硅酸乙酯(TEOS)、氯化十六烷基三甲基铵(CTAC)、苯基三乙氧基硅烷(PTES)，均购于Sigma-Aldrich。5F购于上海超研生物科技有限公司。1640培养基和胎牛血清(FBS)购自Gibco。丙烯酰胺、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、十二烷基硫酸钠(SDS)、过硫酸铵(APS)、四甲基乙二胺(TEMED)、二硫苏糖醇(DDT)、甘氨酸(Gly)、HCl(36%)和溴酚蓝(BPB)购自国药集团化学试剂有限公司。CCK-8试剂盒购自东仁化学科技有限公司。Caspase-3试剂盒、CNE2细胞购自凯基生物技术股份有限公司。整个实验中的用水都是超纯水，所有的试剂都没有经过进一步纯化。

伊利奶粉购自超市。

1.2 多功能荧光核-壳介孔SiO2(CMS)的合成

FITC-APTES的合成：2 mg FITC溶于10 mL无水乙醇中，加入0.05 mL APTES，避光反应20 h，离心、弃去上清液，备用。溶液1：15 mL TEA与1.76 mL TEOS以及113 μL PTES混合加热至90 ℃，反应20 min。溶液2：9.67 mL CTAC与14.44 mL水混合加热到60 ℃。将溶液2加至溶液1中，磁子搅拌500转。加入210 μL TEOS搅拌40 min后，加入1∶1混合的TEOS(21 μL)和APTES-FITC(16.6 μL)，搅拌过夜。后处理：将搅拌过夜的混合物分散在溶解了2 g NH4NO3的100 mL无水乙醇中，90 ℃加热回流45 min，直至溶液澄清。将澄清溶液分散在1∶9混合的HCl和无水乙醇中，加热回流45 min。离心洗涤3次，分散到无水乙醇中。即合成了核上包覆FITC、壳上修饰氨基的核-壳介孔SiO2载体。

1.3 CMS对5F的负载和释放

将5F溶于DMSO中，加水或磷酸盐缓冲溶液(PBS)稀释，制备成DMSO体积分数为3%的溶液。加入超声分散的CMS，磁子搅拌24 h，分别用无水乙醇和水离心洗涤数次，以除去未负载的5F，由此得到CMS@5F。将合成的CMS@5F(1 mg)分别分散在20 mL PBS(pH=7.4)和乙酸缓冲溶液(pH=5.0)中，置于10 000 Ka的透析膜中，室温搅拌进行透析。在特定的时间点，取出8 mL透析膜外的水溶液用紫外-可见分光光度计在242 nm处测量吸收强度，换算5F的浓度，同时补充8 mL的缓冲溶液。

1.4 CMS在细胞中的分布

CNE2细胞分别用20/50/100 μg/mL的CMS@FITC孵育4 h后，用PBS 洗涤细胞2～3次，用4%多聚甲醛固定20 min，再用PBS 洗涤细胞2～3次后用，共聚焦显微镜检测FITC的荧光。FITC用氩离子激光器在488 nm进行激发，发射信号在485～550 nm范围内收集。

1.5 CCK-8实验

将CNE2细胞以4 000个/孔的密度种在三块96孔板中，分别加不同浓度5F、CMS及CMS@5F，在37 ℃ CO2培养箱孵育24 h后，每孔中加10 μL CCK-8继续孵育0.5～4 h(根据颜色变化判断孵育时间)，用酶标仪测定在450nm处的吸光度(OD值)，计算CNE2细胞的存活率。

1.6 Caspase-3活性实验

细胞的Caspase-3活性用相应试剂盒来评估，通过nanodrop检测405 nm处的吸收，吸光度数值越高说明活性越高。

1.7 Western blot比较5F及CMS@5F对磷酸化蛋白激酶(p-ERK1/2)的抑制作用

用浓度一致的5F、CMS及CMS@5F处理细胞后，倒掉培养液，并将培养皿倒扣在吸水纸上吸干培养液，用4 ℃预冷的PBS洗涤细胞三次。将培养皿置于冰上，加入裂解液裂解细胞30 min。用细胞刮将裂解后的细胞刮下，移至1.5 mL离心管中，在4 ℃、12 000 r/min离心5 min，收集上清液，用BCA试剂盒标定蛋白浓度。根据目的蛋白的大小选择浓缩胶和分离胶的浓度，上样跑电泳、转膜及显影。目的条带的宽度直观的反应了5F及CMS@5F对磷酸化蛋白激酶(p-ERK1/2)及下游蛋白p-MSK1的抑制作用。

2 结果与讨论

2.1 荧光标记CMS的表征

图 1 CMS的透射电镜(TEM)图片Fig.1 TEM image of CMS

根据文献合成了包覆FITC、最外层修饰氨基的介孔核壳(CMS)，从透射电镜(TEM)图上可以看到CMS直径大概为80 nm，表面有明显的介孔孔道，并且分散性较好(图1)。表面修饰的氨基使CMS壳层带正电荷，可通过静电相互作用负载带负电荷的5F。

CMS用作载体，首先要考虑其是否具有生物相容性，用不同浓度CMS孵育CNE2细胞24 h后用CCK-8试剂盒检测细胞毒性，结果显示CMS浓度高达200 μg/mL时对细胞活性也没有明显抑制作用，说明CMS对细胞而言是无毒的(图2)。图3的药物释放曲线是根据CMS@5F在pH=7.4的PBS或pH=5.0的乙酸缓冲溶液中释放的5F比率做出的。通过图中两条释放曲线的对比可以明显看出5F在酸性溶液中更容易从CMS的孔道和表面释放以发挥其治疗作用。微环境的酸度变化会影响5F与CMS之间的静电相互作用，使CMS释放5F。

图2 CMS对细胞活性的影响Fig.2 The influence of CMS on cell viability

图3 在不同缓冲溶液中5F的释放曲线Fig.3 The release curves of 5F in different buffer solutions

2.2 CMS在细胞中的分布

CMS是通过内吞作用进入细胞的，为了更直观的观察CMS在细胞中的分布，用不同浓度的CMS孵育CNE2细胞4 h后用共聚焦显微镜观察FITC的荧光。从图4中可以看到随着浓度的增加，CMS进入细胞的量明显增多。由于CMS是纳米级的，所以可以看到FITC的荧光在细胞中是点状分布的，这说明CMS能很好的将5F运送到细胞中。

图4 CMS在CNE2细胞中的分布 Fig.4 The distribution of CMS in CNE2 cells (a)20 μg/mL;(b) 50 μg/mL;(c) 100 μg/mL

2.3 5F和CMS@5F的细胞毒性

通过CCK-8实验评估5F和CMS@5F在不同浓度孵育CNE2细胞24 h后的细胞毒性。从图5中可以看出5F和CMS@5F都有明显的细胞毒性，并随着5F浓度的增加而增强。我们检测了5～100 μg/mL浓度范围内的5F和5F@CMS孵育细胞24 h后对细胞的毒性，结果显示在相同条件下CMS@5F的细胞毒性明显高于单独的5F。当CMS@5F的浓度为50 μg/mL时对细胞的抑制率基本达到100%，而相同浓度5F对细胞的抑制率仅为43%。CMS@5F细胞毒性增强主要是借助了CMS的细胞内吞作用，该作用能有效增大5F在细胞内的局部浓度，诱导细胞凋亡。

我们还检测了与细胞凋亡相关的关键DAMP生物标志物半胱天冬酶-3(caspase-3)在细胞中的浓度水平(图6)，结果显示CMS@5F处理细胞的caspase-3吸光度明显高于5F处理的细胞，这进一步证明了CMS@5F对细胞增殖的抑制效果更好。

图5 不同浓度5F和CMS@5F对细胞生长的抑制Fig.5 The inhibition of cell growth by 5F and CMS@5F of different concentrations

图6 CNE2细胞用5F和CMS@5F处理后caspase-3的活性Fig.6 Activity of caspase-3 in CNE2 cells treated with 5F and CMS@5F

2.4 基因表达分析

图7 凋亡相关蛋白的WB分析Fig.7 Western blotting analysis results of apoptosis related proteins1.Control；2.30 μg/mL 5F;3.5 μg/mL CMS + 30 μg/mL 5F； 4.70 μg/mL 5F；5.5 μg/mL CMS + 70 μg/mL 5F；6.100 μg/mL 5F； 7.5 μg/mL CMS + 100 μg/mL 5F.

为了比较5F和CMS@5F在细胞基因层面引起的差异，我们用不同浓度的5F和CMS@5F处理细胞提取蛋白进行western blot(WB)分析。我们选择了一条重要的细胞增殖和凋亡调控通道，即丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK)信号转导通道作为研究对象。理论上，干扰该信号通路的部分级联通路可实现抗癌效果。而与多种异常肿瘤的发展密切相关的早期应答激酶(细胞外调节蛋白激酶，ERK)就是MAPK家族的一员。ERK信号转导模式是从多种生长因子开始的，Ras-Raf-MSK到细胞生长、发展、分裂和分化，其中MSK是ERK的下游靶分子。在生理过程中，ERK和MSK被激活为p-ERK和p-MSK，两者表达水平越高说明细胞增殖越明显。从图7中可以看到CMS@5F比5F处理的细胞p-ERK和p-MSK表达水平更低，说明CMS负载5F能有效促进抗癌药物对癌细胞的抑制。

3 结论

综上所述，本研究设计了一个药物释放体系负载抗癌药物5F用于鼻咽癌细胞的抑制，5F是通过静电引力吸附在CMS的表面和孔道中的。研究发现，CMS具有优良的生物相容性，在细胞层面没有毒性，能将抗癌药物很好的输送到癌细胞中。我们选择具有代表性的鼻咽癌细胞CNE2作为研究对象来证明CMS在细胞层面对抗癌药物疗效的促进作用，结果证明CMS@5F对癌细胞的抑制效果更好，同时凋亡相关的蛋白表达水平更低。因此，我们期望该药物释放体系的设计能更多用于抗癌药物的负载和释放，以提高药物的治疗效果。