红光发射分子转子的设计与合成

吕维杰， 毛志强， 刘志洪

(生物医学分析化学教育部重点实验室，武汉大学化学与分子科学学院，湖北武汉 430072)

粘度是影响物质在溶液中扩散速率的重要参数之一[1]。粘度通过影响物质的移动性，对物质的运输、信号传导识别及生物大分子相互作用有着极大的影响[2]。同时细胞内粘度的改变与粥样硬化、糖尿病、阿尔茨海默病及肿瘤的发生有一定的关系，是这些疾病潜在的指示指标[3]。因此，检测细胞内的粘度具有非常重要的意义。不同于宏观大体积粘稠流体的粘度的测定可以使用转子粘度计、落球粘度计等仪器，细胞内粘度的测定一般采用基于分子转子的粘度探针。分子转子是一类特殊的荧光材料，其在激发态非辐射跃迁损失的能量随粘度的改变而变化，粘度的增加会阻碍转子的转动，转子非辐射跃迁损失的能量会减少，具体的表现为转子的荧光强度升高[1]。

目前已报道的分子转子大多发射波长较短(<550 nm)，会有比较强的生物背景荧光干扰，且短波的穿透深度有限，不利于生物成像[4 - 5]。为了解决上述问题，本文通过共轭双键连接吸电子基和给电子基,设计合成了红光发射的分子转子2-(2-(4-氨基苯乙烯基)-4-H-吡喃-4-亚基)-丙二腈(DCM-NH2)。该探针的最大发射波长为631 nm，属于远红光，能有效减少生物背景，提高成像信噪比。同时，探针对粘度有很好的响应，具有线性响应范围宽、灵敏度高、对粘度非常敏感等优点。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

RF-5301PC型荧光分光光度计(日本，岛津公司)；UV-2550型紫外-可见分光光度计(日本，岛津公司)；Chameleon Ultra Ⅱ型钛蓝宝石飞秒脉冲激光器(美国，相干公司)；Mercury 300型核磁共振仪(美国，瓦里安)。

对甲酰基苯硼酸购于上海萨恩化学技术有限公司(安耐吉)；哌啶、乙酸铜、冰乙酸均购于上海国药集团化学试剂有限公司；2-(2-甲基-4-H-吡喃-4-亚基)-丙二腈(DCM)根据文献方法[6]合成；依文献用不同体积比的甘油-甲醇配制不同粘度的溶液[7]；所有试剂均为分析纯，实验室所用水为超纯水。

1.2 实验过程

DCM-NH2的合成路线如图1所示。

图1 DCM-NH2的合成路线Fig.1 The synthesis schematic diagram of DCM-NH2

1.2.14-叠氮苯甲醛(PhN3)的合成称取对甲酰基苯硼酸750 mg(5 mmol)，叠氮钠450 mg(7 mmol)，一水CuAc2100 mg(0.5 mmol)加入到100 mL单口瓶中 ，溶于30 mL甲醇，通氩气保护下，55 ℃ 回流3 h。反应结束后，减压蒸馏除去甲醇，粗产品用柱层析色谱分离，淋洗剂为二氯甲烷，真空干燥，得到淡黄色油状液体(400 mg,54%)。1H NMR(400 MHz,CDCl3),δ:9.95(s,1H),7.89(d,J=8 Hz,2H),7.17(d,J=8 Hz,2H)。

1.2.2DCM-NH2的合成将150 mg(1 mmol)PhN3和208 mg(1 mmol) DCM溶于20 mL甲苯中，室温搅拌下加入0.5 mL哌啶，0.5 mL冰HAc，然后120 ℃通氩气保护下反应10 h，减压蒸馏除去甲苯，粗产品用柱层析色谱分离，淋洗剂为甲醇/二氯甲烷(1∶50,V/V)，真空干燥，得到暗红色固体(65 mg,20%)。1H NMR(400 MHz,d6-DMSO),δ:8.71(d,J=8 Hz,1H),7.88(t,J=8 Hz,1H),7.76(d,J=8 Hz,1H),7.63(d,J=16 Hz,1H),7.57(t,J=8 Hz,1H),7.48(d,J=8 Hz,2H),6.85(s,1H),6.61(d,J=8 Hz,2H),6.05(s,2H)。

1.2.3荧光量子产率的测定准确称取一定质量的DCM-NH2，溶于二甲亚砜(DMSO)中，配制为1 mmol/L 的母液待用；然后取母液，采用不同的溶剂稀释到1 μmol/L，在紫外-可见分光光度计上测定其吸收光谱，记录最大吸收波长和最大吸收波长处的吸光度。然后将溶液稀释到最大吸光度在0.05以下，测定其发射光谱用作计算荧光量子产率。

2 结果与讨论

2.1 DCM-NH2在不同粘度溶液中量子产率的测定

为了探究分子转子对粘度是否有响应，首先测定了DCM-NH2在三种不同粘度环境下的荧光量子产率，实验结果列于表1。可以发现，随着粘度的增加，探针的荧光量子产率变大，量子产率从低粘度中的1.8%变为高粘度下的5.2%，增加了2.89倍。这些结果表明粘度的增加阻碍了分子转子的转动，DCM-NH2非辐射跃迁损失的能量变少，探针的荧光强度逐渐增强。由此可以看出，DCM-NH2对粘度有响应。

表1 DCM-NH2在不同粘度溶液中的量子产率

2.2 DCM-NH2在不同溶剂中的光谱性质

为考察溶剂极性对DCM-NH2的荧光变化的影响，分别测试了DCM-NH2在二氯甲烷、丙酮、乙腈、乙醇、甲醇、四氢呋喃中的光谱性质。由图2可以看出， DCM-NH2在这些溶剂中的吸收和发射光谱基本不变，最大吸收波长最多改变了18 nm(467～485 nm)，最大发射波长最多改变了12 nm(651～663 nm)。上述结果表明DCM-NH2的荧光性质不受溶剂极性的影响。

图2 DCM-NH2在不同溶剂中的紫外吸收光谱(A)和荧光发射光谱(B)(归一化后) Fig.2 The normalized absorption(A) and fluorescence spectra(B) of DCM-NH2 in different solvents 1.DCM;2.Acetone;3.Acetonitrile;4.Ethanol;5.Methanol;6.THF.

2.3 DCM-NH2选择性的考察

2.4 DCM-NH2pH稳定性的测定

为了排除pH对探针荧光强度的影响，测试了溶剂体系中pH值的改变对荧光强度的影响(图4)。实验结果表明，在pH=4～9的范围内，DCM-NH2的荧光强度基本保持不变，表明DCM-NH2对pH不敏感，具有很好的pH稳定性。

图3 DCM-NH2对常见离子的响应Fig.3 Fluorescence responses of DCM-NH2(5 μmol/L) to viscosity and various ions(500 μmol/L)

图4 DCM-NH2对pH的响应Fig.4 Fluorescence responses of DCM-NH2(5 μmol/L) to various pH

2.5 DCM-NH2对粘度的响应

在证明了DCM-NH2对粘度具有良好的选择性和灵敏度的基础上，进一步探究了DCM-NH2对不同粘度的荧光响应。从图5A结果可知，随着溶液粘度的增加，染料的荧光逐渐增强。在低粘度区和高粘度区，荧光强度与粘度表现出两种线性曲线，荧光强度与粘度η均符合Förster-Hoffmann方程:

logIf=c+xlogη

(3)

其中，If为染料荧光强度,c为与浓度和温度相关的常数，x为与染料和温度相关的常数，η为溶剂的粘度。在低粘度区(0.6～30.6 cP)，logIf=(0.033±0.0013)logη+c，R2为0.99；在高粘度区(30.6～458.6 cP)，logIf=(0.20±0.014)logη+c，R2为0.98。由此可以看出，DCM-NH2对粘度有着非常好的线性响应，其线性响应范围非常宽(0～458.6 cP)。同时DCM-NH2最大发射波长为631 nm，属于远红光，能有效降低生物背景，提高成像信噪比，非常适于生物成像。因此，探针具有检测细胞中粘度的应用前景。

图5 不同粘度溶液中DCM-NH2(10 μmol/L)的荧光发射光谱(A)及荧光强度对数与溶液粘度对数的线性关系(B)Fig.5 The Fluorescence spectra(λex = 500 nm)(A) and linear relationship between logIf and logη(B)

图6 不同波长下的双光子活性截面Fig.6 Two-photon action cross section of DCM-NH2

2.6 DCM-NH2双光子荧光截面的测定

基于DCM-NH2优良的检测性能，同时考虑到双光子荧光探针在成像上具有背景荧光低、光损伤小、成像深度大的优点，我们对DCM-NH2的双光子吸收性质进行了考察(图6)。从图6可以看出在780～840 nm双光子激发波长范围内，DCM-NH2具有双光子吸收性质。在820 nm激发下DCM-NH2具有最大的双光子活性截面(Φδ)24 GM(1 GM = 10-50cm4·s·photons-1·melecule-1),表明DCM-NH2可望用于细胞或组织中粘度的双光子成像。

3 结论

本文设计并合成了基于扭转分子内电荷转移的红光发射的分子转子DCM-NH2，该探针对粘度有很好的线性响应，探针的线性响应范围宽(0.6～458.6 cP)，灵敏度高，同时该探针具有红光发射特性，穿透深度深且能有效降低生物背景，有利于生物成像。