电针内关穴预处理对心肌缺血再灌注损伤大鼠NO、NOS及线粒体膜电位的影响

宋瑾,王超,阳仁达,冯果,谭成富,刘薇薇,严洁

(湖南中医药大学针灸推拿学院,长沙 410208)

·动物实验·

电针内关穴预处理对心肌缺血再灌注损伤大鼠NO、NOS及线粒体膜电位的影响

宋瑾,王超,阳仁达,冯果,谭成富,刘薇薇,严洁

(湖南中医药大学针灸推拿学院,长沙 410208)

目的通过测定心肌缺血再灌注损伤(MIRI)大鼠一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)及线粒体膜电位,探讨电针内关穴预处理对心肌缺血再灌注损伤(MIRI)大鼠NO、NOS及线粒体膜电位的影响。方法将40只SD雄性大鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组(模型组)、电针内关穴组和电针环跳穴组,每组10只。采用冠脉结扎法造模,电针内关组和电针环跳组在造模前,分别给予电针刺激20 min/d,共7 d。记录造模前后心电图Ⅱ导联T波电压值,HE染色检测心肌病理形态学的变化,采用硝酸还原酶化学比色法检测血清NO、NOS的含量,荧光技术法测心肌细胞线粒体膜电位的变化。结果模型组血清NO、NOS含量及线粒体膜电位较假手术组明显下降(P＜0.01,P＜0.05);电针内关穴组血清NO、NOS含量较模型组、假手术组和电针环跳组明显升高(P＜0.01,P＜0.05);电针内关穴组线粒体膜电位较模型组、电针环跳穴组和假手术组明显升高(P＜0.05);模型组与电针环跳穴组间无明显差异(P＞0.05)。结论电针内关穴预处理对MIRI大鼠具有预保护作用,可以通过提高NO含量、增强NOS活性,减少心肌细胞线粒体膜电位下降,抑制细胞凋亡,从而对心肌产生保护作用。

心肌再灌注损伤;电针;穴,内关;一氧化氮合酶;线粒体膜电位;大鼠

近年来,随着冠心病的发病率逐年上升,发病年龄逐渐年轻化,有的发病年龄甚至不到30岁,因此,掌握冠心病的预防及治疗方面的基本常识显得尤为重要,本课题组经过大量的实验及临床研究证明电针内关穴对心肌缺血有明显的改善作用[1-5]。一氧化氮(NO)是机体内重要的信使分子和效应分子,为神经传递、血管舒张、调节神经功能的内源性介质,与神经系统的生理和病理过程关系密切[6-8],而一氧化氮合酶(NOS)是 NO生物合成的限速酶。线粒体是介导细胞凋亡的重要细胞器,且可能是引发衰老和疾病的基础原因。而两者密切相关的关键点就是线粒体膜电位,线粒体膜电位是维持线粒体功能和结构的根本,它的改变将会造成线粒体膜发生一系列的功能和状态的变化,线粒体膜电位的丧失被认为是心肌细胞凋亡早期的一个显著的特征。内关穴为手厥阴心包经之络穴,又为八脉交会穴之一,通于阴维脉,主治心痛、胸闷、心烦等心脏疾病及经脉循行部位的其他疾病[9-11]。本实验主要通过观察电针内关穴对实验性大鼠心肌缺血后再灌注损伤与内源性保护物质NO、NOS及心肌线粒体膜电位的关系,为针刺内关穴防治心血管疾病及经穴脏腑理论提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

选取SPF级雄性SD大鼠,250～300 g,共40只,由湖南中医药大学动物实验中心提供(SYXK湘 2013-0005,SCXK湘2013-0004)。随机分为4组,假手术组、缺血再灌注模型组、针刺内关穴组、针刺环跳穴组,每组10只。

1.2 主要试剂与设备

细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒(南京建成生物工程研究所);免疫组化检测腺苷A1受体试剂盒,腺苷A1受体抗体规格1 mL(美国Santacruz公司),图像分析软件为 IPP(Image-Pro-Plus),显微镜(MOTIC BA210T);华佗牌 SDZ-Ⅴ型电子针疗仪(苏州医疗用品厂有限公司);汉医牌一次性使用无菌针灸针(0.25 mm×13 mm,100支/盒)(长春爱泉医疗器械有限公司);医用离心机台式高速离心机 H1850动(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司);数字式心电图机 ECG-1106G(深圳市凯沃尔电子有限公司);动物呼吸肌 ALC-V108(上海奥尔科特生物科技有限公司);流式细胞仪(南京建成生物工程研究所)。

1.3 造模方法

造模参照汪谦[12]的方法,大鼠 250～300 g以10%水合氯醛麻醉0.3 mL/100 g腹腔注射。行气管插管后,接动物人工呼吸机(频率 70～80次/min,潮气量 5～6 mL/100 g),然后沿左侧第4、5肋骨间开胸,轻轻剪破心包膜,提起左心耳,在冠状动脉左前降支1/3处穿4“0”号线,置一硅胶管结扎,以心电图ST段的改变及冠脉向外膨胀发绀为结扎成功标志,结扎 40 min后,剪开/取下硅胶管恢复左前降支灌流60 min,腹主动脉取血3～5 mL,摘取心脏。

1.4 穴位定位及处理方法

1.4.1 穴位定位

内关、环跳定位参照林文注主编《实验针灸学》并结合解剖学定位。内关位于前肢内侧,离腕关节约3 mm左右的尺桡骨缝间。环跳穴位于股骨大转子后上缘凹陷处。

1.4.2 处理方法

参照汪谦[12]的方法,假手术组和模型组饲养至第7天,其中假手术组开胸,左冠状动脉前降支上、中1/3交界处穿线不结扎,40 min后,再灌注60 min后,记录心电图,模型组左冠状动脉前降支上、中1/3交界处穿线结扎,40 min后,再灌注60 min后,记录心电图。电针内关穴组和电针环跳穴组在进行心肌缺血再灌注损伤造模之前 7 d,每天给予电针刺激,分别针刺双侧内关穴和环跳并连接 SDZ-V型电子针疗仪(10 Hz,疏密波),时间20 min,每日1次,共针刺7次后再行造模。

1.5 检测指标及方法

1.5.1 心电图Ⅱ导联T波

分别打印各组大鼠术前、结扎后 1 min、结扎后40 min、再灌注后60 min心电图图纸,选取Ⅱ导联T波电压作为观察指标,量取每只大鼠连续10个心动区间的T波电压值,并计算出10个心动区间T波的平均值。

1.5.2 光镜及电镜观察大鼠左心室缺血心肌细胞形态学的变化

1.5.2.1 标本采集

各组大鼠分别在造模结束后取材,用眼科小剪刀取下左冠状动脉前降支穿线(假手术组)或结扎(模型组、电针内关组及电针环跳组)下段左心室心肌组织,将剪取的心肌组织迅速以冰冷的生理盐水洗净,并分成两份,将其中一份心肌组织迅速修成 5 mm×1 mm×1 mm组织块(约距心尖3～5 mm区域)后浸入2.5%戊二醛固定 24 h(4℃)用于观察左心室缺血区组织超微结构;另一份心肌组织迅速放入含有0.1%DEPC的4%多聚甲醇固定液中固定,用于HE染色及免疫组化检测。

1.5.2.2 HE染色观察左心室缺血区组织病理形态学的变化

石蜡切片厚度5 μm,裱于干净载玻片上,60℃烘箱中烤片4 h,而后二甲苯脱蜡两次,每次15 min→100%乙醇Ⅰ→100%乙醇Ⅱ→95%乙醇→80%乙醇→蒸馏水苏木素染胞核 10 min→10%盐酸乙醇分化→自来水冲15 min(反蓝)→蒸馏水Ⅰ→蒸馏水Ⅱ→伊红染胞浆→各级乙醇脱水→二甲笨透明→树脂胶封片→光镜下观察心肌细胞组织形态学变化,照相。

1.5.3 JC-1染色法测线粒体膜电位

取500 μL JC-1工作液将细胞均匀悬浮,37℃,5%CO2的培养箱中孵育 15～20 min;室温离心(200 rpm,5 min)收集心肌细胞,用 500 μL 1×染色结合液洗两次;吸取500 μL 1×染色结合液重新悬浮细胞,用流式细胞仪进行流式检测。

1.5.4 硝酸还原酶化学比色法测NO、NOS

按NO、NOS试剂盒检测步骤,用754紫外分光光度计测定NO、NOS活性;以硝酸还原酶比色法测定其组织蛋白含量。

1.6 统计学方法

应用SPSS16.0统计软件,计量资料以均数±标准差表示。所有数据进行正态性检验,满足正态性时,采用单因素方差分析。组间比较若方差齐时采用LSD法检验,方差不齐时用Tamhane’s T2法检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 电针内关穴对大鼠心电图T波的影响

各组大鼠术前T波电压比较差异无统计学意义(P＞0.05),说明各组大鼠术前齐同可比。造模后各时段模型组、电针内关组、电针环跳组与假手术组比较差异有统计学意义(P＜0.01,P＜0.05),表明造模成功。结扎后40 min与再灌注60 min,与模型组比较,电针内关组T波均明显下降(P＜0.01),而电针环跳组与模型组之间无明显差异(P＞0.05),与电针内关组比较,电针环跳组T波均明显升高(P＜0.01)。以上结果提示,电针内关穴预处理能改善心肌缺血再灌注大鼠心电图T波。详见表1。

表1 各组大鼠结扎后T波的比较 (±s)

表1 各组大鼠结扎后T波的比较 (±s)

注：与假手术组比较1)P＜0.01,2)P＜0.05;与模型组比较3)P＜0.01;与电针内关组比较4)P＜0.01

组别 n 结扎前 结扎后1 m i n 结扎后4 0 m i n 结扎后6 0 m i n假手术组 1 0 0.2 0 3±0.0 2 1 0.2 8 4±0.0 3 3模型组 1 0 0.2 0 8±0.0 2 4 0.4 1 9±0.0 4 41)电针内关组 1 0 0.2 0 7±0.0 2 2 0.3 8 8±0.0 4 31)电针环跳组 1 0 0.2 0 9±0.0 1 7 0.4 1 8±0.0 4 11)0.2 8 2±0.0 2 3 0.2 7 7±0.0 2 3 0.6 3 8±0.0 4 01) 0.4 1 6±0.0 4 21)0.4 9 4±0.0 3 91)3) 0.3 6 2±0.0 4 92)3)0.6 0 8±0.0 6 61)4) 0.4 1 1±0.0 4 61)4)

2.2 电针内关穴对大鼠心肌组织病理学改变的影响

假手术组心肌组织无明显病理变化,心肌细胞排列整齐,胞核形态正常,胞质无嗜酸性变。模型组心肌细胞严重紊乱、断裂,胞核固缩及胞浆嗜酸性变明显,充血、水肿及炎细胞浸润明显。电针内关穴组心肌细胞紊乱、断裂程度较轻,核固缩及胞浆嗜酸性变明显减少,无明显充血、水肿。电针环跳组心肌细胞紊乱、断裂,核固缩及胞浆嗜酸性变明显,有明显充血、水肿及炎细胞浸润。详见图1。

图1 各组大鼠心肌组织病理学改变(×400)

2.3 电针内关对MlRl 大鼠NO、NOS含量的影响

模型组血清NO、NOS的含量与假手术组相比明显下降(P＜O.01,P＜0.05);电针内关穴组血清 NO、NOS含量较模型组明显升高(P＜0.01);电针内关穴组血清NO、NOS含量较假手术组和电针环跳组明显升高(P＜O.01,P＜0.05);而电针环跳穴组与模型组间无明显差异(P＞0.05)。以上结果提示,电针内关穴预处理可以使心肌缺血再灌注损伤大鼠血清中 NO的含量升高,NOS的活性增强。详见表2。

表2 各组大鼠血清NO、NOS含量的比较 (±s,μmol/L)

表2 各组大鼠血清NO、NOS含量的比较 (±s,μmol/L)

注：与假手术组比较1)P＜O.05,2)P＜O.01;与模型组比较3)P＜0.01;与电针环跳组比较4)P＜0.05,5)P＜0.01

组别 n NO NOS假手术组 10 45.00±8.01 35.44±2.14模型组 10 30.52±6.241) 32.24±3.182)电针内关组 10 51.75±7.183)4) 37.80±1.943)5)电针环跳组 10 38.94±14.75 34.20±3.74

2.4 电针内关对MlRl大鼠线粒体膜电位的影响

当线粒体膜电位较高时 JC-1聚集在线粒体的基质中,形成聚合物,可以产生红色荧光;在线粒体膜电位较低时,形成单体,产生绿色荧光,用流式细胞仪检测细胞凋亡的情况,绿色荧光通过 FITC通道通常为FL1来检测,红色荧光通过PI通道通常为FL2来检测。正常细胞(FL-1亮,FL-2亮;R1),凋亡细胞(FL-1亮,FL-2暗;R2),流失检验结果如图2。R1(右上限)代表正常细胞,R2(右下限)代表凋亡细胞,流式细胞仪检测到的显绿色荧光的细胞数(凋亡细胞)可间接反映细胞线粒体膜电位的大小,凋亡细胞值越大,线粒体膜电位就越低。各组大鼠心肌细胞线粒体膜电位见表3。

表3 各组大鼠心肌细胞线粒体膜电位的比较 (±s,%)

表3 各组大鼠心肌细胞线粒体膜电位的比较 (±s,%)

注：与假手术组比较1)P＜O.01;与模型组比较2)P＜0.05;与电针环跳穴组比较3)P＜0.05

组别 n R 1(红色荧光)正常细胞(%)R 2(绿色荧光)凋亡细胞(%)假手术组 1 0 3 0.2 6±5.0 9 6 9.6 7±5.0 3模型组 1 0 1 0.2 3±1.7 51) 8 9.9 5±1.5 61)电针内关组 1 0 3 0.5 9±1 6.5 42)3) 6 9.0 9±1 6.5 52)3)电针环跳组 1 0 1 2.1 5±3.1 6 8 7.7 9±3.1 7

图2 各组流式检验结果

表3所示模型组凋亡细胞较假手术组有所升高(P＜0.01),则线粒体膜电位就越低;电针内关穴组凋亡细胞较模型组和电针环跳组明显下降(P＜0.05),则线粒体膜电位越高;而电针环跳穴组与模型组间无明显差异(P＞0.05),电针环跳组与假手术组间也无明显差异(P＞0.05)。以上结果提示电针内关穴预处理可以使MIRI大鼠线粒体膜电位升高。

3 讨论

本研究选用在体大鼠心肌缺血再灌注损伤模型来模仿心肌梗死患者接受再灌注治疗的临床事件。心肌缺血再灌注损伤(MIRI)是在心肌缺血恢复血流后,其细胞代谢功能障碍及结构破坏反而加重的现象,这种由再灌注诱发的一系列有害反应,损伤表现为心肌顿抑,心肌坏死和心肌凋亡等[13]。缺血再灌损伤的机制也较为复杂,参与因素众多。

NO是生物体内重要的信使分子和效应分子,具有神经介质和调质的功能,广泛参与体内生理和病理活动。一氧化氮(NO)的合成需一氧化氮合成酶(NOS)的催化才能完成,NOS为一含铁的单氧化酶,主要分布于血管内皮细胞、神经细胞、中性粒细胞和巨噬细胞等细胞内,可催化左旋精氨酸转化为瓜氨和 NO[14],NO、NOS共同参与调控冠脉血管的收缩与舒张,对缺血后心功能的恢复及预后具有重要作用。但是NO在心肌缺血再灌注中是起保护因子作用抑或是起细胞毒性作用目前尚有争议,NO可能发挥损伤或保护的双重作用[15]。一些研究发现,缺血再灌注模型组NOS活性增强、NO释放增多,组织形态学观察可见肌原纤维内大量收缩带,肌质网扩张,肌纤维内脂滴增多,心肌细胞连接处电子密度降低,肌丝排列稀疏,润盘解离,局部肌纤维内线粒体肿胀嵴疏松,部分嵴消失,心肌细胞损伤严重[16]。本研究中模型组血清NO和NOS含量明显低于假手术组,说明心肌缺血再灌注损伤能抑制NOS的活性,减少NO含量的生成;电针内关穴组NO、NOS含量明显多于模型组,说明电针内关穴可以提高NOS的活性,促进NO的生成;而电针环跳组与模型组间NOS、NO含量无明显差异,同时电针内关组与电针环跳组相比NOS、NO含量明显升高,说明内关穴对心肌损伤具有特异性的保护作用,为“胸胁内关谋”脏腑经脉理论提供依据。

线粒体膜电位是维持线粒体功能和结构的根本,它的改变将会造成线粒体膜发生一系列的功能和状态的变化。线粒体跨膜电位的下降被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件。本研究结果显示,与假手术组比,模型组出现大量凋亡细胞,且差异具有统计学意义,说明缺血再灌注损伤会导致线粒体膜电位下降,破坏线粒体膜的完整性;同时与缺血再灌注组比,电针内关组凋亡细胞数明显减少,差异具有统计学意义,结果说明电针内关穴预处理可以提高心肌细胞线粒体膜电位,减少心肌细胞凋亡,从而保护心肌;与电针环跳组相比,电针内关穴组心肌细胞凋亡数明显减少,差异具有统计意义,说明内关穴作为手厥阴心包经之络穴,对保护心肌具有特异性作用。

有研究报道,NO通过抑制复合体Ⅰ阻止线粒体氧化应激,能够抑制线粒体通透性转移孔(MPTP)的开放,从而保持线粒体膜电位的稳定,发挥再灌注心肌保护作用[17]。本课题组近10年来,一直在研究电针内关穴对大鼠、家兔MIRI的保护作用及其机理,结果证明了电针内关穴对MIRI具有保护作用。以上实验结果证实电针内关穴预处理对MIRI大鼠的保护作用,其可能作用机制与电针内关穴预处理可以增加心肌组织 NO含量、提高NOS活力,减少心肌细胞线粒体膜电位下降,稳定线粒体膜电位有关,从而达到抑制心肌细胞凋亡,减轻心肌再灌注损伤的目的。同时也证实了内关穴为保护心肌的特异性穴位,更好地为中医治未病、脏腑经脉理论、“胸胁内关谋”提供实验依据,也给我们临床电针内关治疗心血管疾病提供了保障。

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Effect of Point Neiguan(PC6) Electroacupuncture Pretreatment on NO, NOS and Mitochondrial Membrane Potential in Rats with Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury

SONG Jin,WANG Chao,YANG Ren-da,FENG Guo,TAN Cheng-fu,LIU Wei-wei,YAN Jie.Hunan University of Traditional Chinese Medicine School of Acupuncture and Massage,Changsha410208,China

ObjectiveTo explore the effect of point Neiguan(PC6) electroacupuncture pretreatment on nitric oxide(NO), nitric oxide synthase (NOS) and mitochondrial membrane potential by determining NO, NOS and mitochondrial membrane potential in rats with myocardial ischemia/reperfusion injury (MIRI).MethodForty male SD rats were randomized to sham operation, ischemia/reperfusion model, point Neiguan electroacupuncture and point Huantiao(GB30) electroacupuncture groups, 10 rats each. The model was made by coronary artery ligation.Before model making, electroacupuncture was given to the point Neiguan electroacupuncture and point Huantiao electroacupuncture groups, 20 min/d for a total of 7 d. T wave value in ECG lead Ⅱ was measured before and after model making. Myocardial pathomorphological changes were examined by HE staining. Serum NO and NOS contents were measured by a colorimetric nitrate reductase assay. Cardiomyocyte mitochondrial membrane potential was determined by fluorescence techniques.ResultSerum NO and NOS contents and mitochondrial membrane potential decreased significantly in the model group compared with the sham operation group (P＜0.05). Serum NO and NOS contents increased significantly in the point Neiguan electroacupuncture group compared with the model,sham operation and point Huantiao electroacupuncture groups (P＜0.01, P＜0.05). Mitochondrial membrane potential increased significantly in the point Neiguan electroacupuncture group compared with the model, point Huantiao electroacupuncture and sham operation groups (P＜0.01, P＜0.05). There was no statistically significant difference in mitochondrial membrane potential between the model and point Huantiao electroacupuncture groups (P＞0.05).ConclusionPoint Neiguan electroacupuncture pretreatment has a preventive protecting effect on MIRI rats. It produces a protecting effect on myocardium by increasing the NO content, strengthening NOS activity, reducing a decrease in cardiomyocyte mitochondrial membrane potential and inhibiting apoptosis.

Myocardial reperfusion injury; electroacupuncture; Point, Neiguan(PC6); Nitric oxide synthase;Mitochondrial membrane potential; Rats

R2-03

A

2017-03-25

10.13460/j.issn.1005-0957.2017.10.1247

1005-0957(2017)10-1247-06

国家自然科学基金项目(81574080);湖南省中医药管理局课题(2015211);湖南省高校创新平台开放基金项目(15k093); 2015年针灸推拿学湖南省“十二五”重点学科开放基金项目(序号06)

宋瑾(1990—),女,2014级硕士生

王超(1974—),女,副教授,硕士生导师,硕士,Email：592436380@qq.com