内蒙古西部地区12份苜蓿根瘤菌株的16SrDNA鉴定

闫 伟，石凤翎，钱亚斯

(内蒙古农业大学草原与资源环境学院，内蒙古 呼和浩特 010019)

内蒙古西部地区12份苜蓿根瘤菌株的16SrDNA鉴定

闫 伟，石凤翎*，钱亚斯

(内蒙古农业大学草原与资源环境学院，内蒙古 呼和浩特 010019)

在内蒙古西部的4个地区(呼和浩特市，沙尔沁，海流图，达拉特旗)，从9份豆科牧草材料(7份苜蓿属材料，2份草木樨属材料)上采集分离得到12份苜蓿根瘤菌株。通过16SrDNA鉴定，确定从草原3号杂花苜蓿(达拉特旗)和新疆大叶紫花苜蓿(海流图)上分离的2份菌株为固氮根瘤菌属(Rhizobium)，而另外10份菌株均为苜蓿中华根瘤菌属(Sinorhizobium)；采集于同一地点不同植物材料上的菌株大多数表现为亲缘关系较近。

苜蓿；根瘤菌；16SrDNA

Abstract：12 Alfalfa Rhizobia Strains isolated from 9 legume forage material(7 Medicago material, 2 parts of the Melilotussuaveolens material) in the four western regions of Inner Mongolia (Hohhot, Shaerqin, Hailiutu, Dalad Banner).Two strains isolated from the M.variaMartin.cv.Caoyuan No3. (Dalad Banner) and M.sativa L. cv. Xinjiangdaye (Hailiutu) were identified by 16SrDNA identification as Rhizobium, while the other 10 strains were Sinorhizobium；The strains showed close relationship which isolated from different materials but the same regions.

Keywords:Alfalfa; Rhizobia; 16SrDNA

在苜蓿栽培生产中，特别是在新开垦的土地和未种植过豆科作物的土地上种植苜蓿时，接种根瘤菌可显著提高苜蓿成苗率和固氮能力。因此，接种根瘤菌是苜蓿栽培中的重要技术措施〔1〕。但目前利用根瘤菌剂接种仍存在一些问题，如这些菌剂在土壤中的生存竞争性能不如土著根瘤菌，菌剂施用的广谱性能不佳，同时又由于各菌剂对特定豆科植物具有专一性，同一菌剂的施用还会因地域和环境不同而产生一定的差异〔2〕。为了获得根瘤菌剂最佳的接种增产效果，需针对种植环境及寄主植物选择最佳匹配的根瘤菌〔3-4〕。因此，为获得适宜内蒙古西部地区不同土壤条件下接种的苜蓿根瘤菌菌株，需要对相关牧草根际微生物进行分离和鉴定，为进一步的接种和匹配试验研究奠定基础。

本试验对内蒙古西部地区不同土壤条件下苜蓿属和草木樨属的牧草材料根瘤菌进行了采集，通过分离、培养、鉴定，以明确不同材料及不同土壤条件下的根瘤菌种类。

1 材料与方法

1.1根瘤菌采集地的地理位置

12份菌株采集于内蒙古西部的4个地点，分别为内蒙古自治区土默特左旗沙尔沁基地(N40°34′54″，E111°46′54″，海拔1 050m)、土默特左旗海流基地(N40°31′17″,E111°23′46″，海拔1 008m)、呼和浩特市内蒙古农业大学新校区(N40°41′30″，E111°22′30″，海拔1 055m)达拉特旗关碾房(N40°19′7″，E109°59′52″，海拔1 030m)。

1.2采集地土壤养分状况

各采集地地势平坦，土壤主要养分含量见表1。

表1 4个采集地点土壤养分含量

1.3供试菌株植物材料

12份根瘤菌菌株采集地和植物材料详见表2。

表2 供试菌株

按上述组分配制好反应液，分装于PCR管中，加入模板DNA混匀后进行PCR反应。

PCR反应条件：

4℃保藏

PCR扩增产物的检测

PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶，100V、40min水平电泳，凝胶成像系统拍照，目标条带约1800bp。

图1 供试菌株PCR凝胶电泳

(3)序列测定及序列数据分析:

将PCR产物送至华大基因公司测序，通过Internet网(http://www.ncbi.nlm.nihgov/blast.cgi)进行比对，选取同源性95%以上的11株细菌，用Mega(4.0)程序包中的Neighbor-Joining法构建系统进化树，确定各根瘤菌在微生物系统发育学上的地位。

2 结果与分析

2.1 12份菌株的分类地位

通过各菌株的系统发育树表3可知，12份根瘤菌菌株中H8与DC3与菌株RhizobiumgiardiniistrainH152相似性最高，达99%，为固氮根瘤菌属Rhizobium；其余10份菌株均为苜蓿中华根瘤菌属Sinorhizobium，其中菌株H2、SJN、XBC、XHC、HH与Sinorhizobiumkummerowiaestrain CCBAU 71714菌株相似性达99%，H7与菌株Sinorhizobiummelilotistrain IAM 12611相似性达99%，SWL、XH与菌株Sinorhizobiummelilotistrain NBRC 14782相似性达99%，而SD与菌株Sinorhizobiumsaheli strain NBRC 100386相似性达99%，与该属内其余种的亲缘关系较远。

表3 12份菌株的分类地位

2.2 12份菌株种属关系的差异

由图3可知，在不同土壤条件下从草原3号杂花苜蓿上分离得到的菌株DC3(关碾房)与H7(海流图)分属于两个根瘤菌属的菌株；黄花草木樨在2种土壤条件下的菌株为同一属，但亲缘关系较远。

在同一土壤环境下，从不同材料上分离得到的各菌株均表现为亲缘关系较近。分离自呼和浩特市的3份菌株(黄花草木樨的2株菌株XH与XHC及白花草木樨的菌株XBC)亲缘关系较近、分离自沙尔沁苜蓿属材料的3株菌株SWL、SJN、SD菌株的亲缘关系较近、分离自海流图苜蓿属2株菌株(草原3号杂花苜蓿菌株H7、呼伦贝尔黄花苜蓿菌株H2)与1株草木樨属材料的菌株(黄花草木樨菌株HH)的亲缘关系较近。

图3 Neighbour Joining法构建的12份菌株系统进化树

3 讨论

采集于不同地点的菌株，可能与不同土壤的养分差异、地区气候条件及土壤微生物菌群与寄主植物的互作等密切相关〔8～12〕。从本试验结果也进一步证明，采集于同一地点下不同材料上的菌株，其亲缘关系均较近；对于采集于不同地点上的同一材料的菌株可能分属于两个属或同属内亲缘关系较远。

在本试验中发现，寄主种子经过商品菌剂的包衣(SWL)与同地采集的未包衣寄主材料的菌株(巨能7号SJN)亲缘关系相近，由此说明2菌株中经接种的前处理无效或所接种的菌剂与该地采集的菌株SJN(土著根瘤菌)相同。

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Identificationof12AlfalfaRhizobiaStrainsby16SrDNAofInnerMongoliawesternregion

YanWei,ShiFengling*,QianYasi

(CollegeofGrassland,ResourceandEnvironmental,InnerMongoliaAgriculturalUniversity;Hohhot010019,China)

S154.38+1

A

2095—5952(2017)03—0036—06

2017-07-24

农业部公益行业(农业)科研专项“苜蓿高效种植技术研究与示范”(201403048)、内蒙古自治区草原英才“内蒙古高原乡土草种质资源遗传改良与利用”创新团队

闫 伟(1990- )，男，内蒙古鄂尔多斯人，在读硕士研究生，研究方向为牧草遗传与育种，E-mail：328694586@qq.com。

石凤翎 E-mail：sfl0000@126.com