MALDI SepsityperTMKit 和血清分离胶促凝管法两种前处理方法在基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术直接鉴定阳性血培养病原菌的应用评估

秦娟秀， 黄 芊， 高倩倩， 谢乙慧， 李 敏， 张灏旻

MALDI SepsityperTMKit 和血清分离胶促凝管法两种前处理方法在基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术直接鉴定阳性血培养病原菌的应用评估

秦娟秀， 黄 芊， 高倩倩， 谢乙慧， 李 敏， 张灏旻

目的比较MALDI SepsityperTMKit 和血清分离胶促凝管法两种前处理方法在基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix- assisted laser desorption ionization- time of fl ight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）技术直接鉴定血培养阳性病原菌的有效性。方法收集上海交通大学医学院附属仁济医院2016年4－6月血培养仪报警的非重复血培养瓶138个，以传统培养鉴定的方法为金标准，同时采用以上两种前处理方法处理阳性标本，再进行MALDI-TOF MS鉴定。结果本次共收集非重复的血培养阳性标本138份，排除6个假阳性血瓶，鉴定出的病原菌包括革兰阴性菌70株（53.03%）、革兰阳性菌57株（43.18%）、真菌3株和2例复数菌。MALDI SepsityperTMKit 和血清分离胶促凝管法两种前处理方法的血培养快速鉴定病原菌准确率分别为91.67%和84.09%，种鉴定准确率分别为83.33%和61.36%。两种前处理方法处理后，革兰阴性菌的准确率分别为98.57%和 95.71%，革兰阳性菌的准确率分别为87.72%和78.59%，两者鉴定所需时间为40 min/样本和25 min/样本。结论虽然MALDI SepsityperTMKit 比血清分离胶促凝管法鉴定准确率稍高但两者差异无统计学意义（91.67%对84.09%，P＞0.05），与MALDI SepsityperTMKit相比，血清分离胶促凝管法是一种快速、易获得、低廉的MALDI-TOF MS直接鉴定血培养病原菌的前处理方法。

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱； MALDI SepsityperTMKit； 血清分离胶促凝管法； 血培养； 病原菌

Abstract: ObjectiveThe aim of this study was to evaluate the commercial Sepsityper™ kit and serum separator tube coupled with matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry for direct identification of microorganisms in a blood culture system.MethodsA total of 138 clinical blood samples from clinical laboratory in Renji hospital were tested with two methods respectively from April to June of 2016. Performance of the assays were compared against that of conventional bacterial culture as a reference.ResultsA total of 138 nonduplicate positive blood culture samples were collected,including 70 (53.03%) gram negative samples, 57 (43.18%) gram positive samples, 3 fungus samples, 2 mixed samples, and 6 false positive samples which were excluded from further analysis. The accuracy rate of Sepsityper™ kit and serum separator tube was 91.67% and 84.09% in rapid identification of pathogen from blood samples, 83.33% and 61.36% in correct identification to species level. The accuracy rate of Sepsityper™ kit and serum separator tube was 98.57% and 95.71% in identifying gram-negative bacteria, 87.72% and 78.59% in identifying gram-positive bacteria, respectively. The turnaroundtime for identification of each sample was 40 min by the commercial Sepsityper™ kit and 25 min by serum separator tube.ConclusionsMALDI SepsityperTMkit has shown slightly higher accuracy rate in identi fi cation of pathogen from blood sample than serum separator tube, but the difference is not signi fi cant (91.67% vs. 84.09%,P＞0.05). Compared with MALDI SepsityperTMkit,serum separator tube is a rapid, easy, and cost-effective pretreatment method for direct identi fi cation of microorganisms from blood cultures using MALDI-TOF mass spectrometry.

Key words:matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry; MALDI Sepsityper™ Kit; serum separator tube as pretreatment methods; blood culture; pathogen

血流感染是临床非常危重的感染类型，有较高的发病率和致死率。据估计，全球范围内每年约1 900万人发生脓毒血症[1]。依据CHINET细菌耐药性监测网数据，2012年我国血流感染分离菌株数较2011年增加了21.4%[2]。传统的微生物鉴定方法主要是基于表型的检测，包括革兰染色，微生物培养和生化试验等，往往耗时较长，需要至少72 h才能将结果反馈临床。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（matrix- assisted laser desorption ionization- time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）是近年发展起来的一种新型的细菌鉴定技术，不仅可以快速准确鉴定细菌，还可用于一些无菌样本如血液和尿液的直接鉴定，极大地缩短了检测时间[3-5]。而MALDI-TOF MS直接鉴定血液和无菌体液是否准确取决于样品的前处理。MALDI SepsityperTMKit是德国布鲁克公司推出专门用于血培养直接鉴定的前处理试剂盒，同时与本实验室采用的血清分离胶促凝管法进行比较，并以传统的培养方法作为参考方法，来评估两种方法快速鉴定血培养阳性的有效性，从而找出适合不同实验室的前处理方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1菌株来源 收集2016年4－6月上海仁济医院第1次培养阳性的血培养瓶进行研究。

1.1.2仪器与试剂 MALDI-TOF MS、MALDI SepsityperTMKit和α-氰基-4-羟基肉桂酸基质（HCCA）购自德国Bruker Daltonik公司；BACTECTM FX 血培养系统、 血清分离胶促凝管、需氧和厌氧血培养瓶购自美国BD公司；甲酸、无水乙醇和乙腈购自美国Sigma-Aldrich公司；VITEK 2-Compact 全自动微生物分析系统和鉴定板条购自法国生物梅里埃公司；需氧血平皿、厌氧血平皿、麦康凯平皿和巧克力平皿购自英国OXIOD公司。

1.2 方法

1.2.1血培养阳性 直接革兰染色涂片镜检培养阳性，取出阳性瓶，记录阳性时间，并将阳性瓶中抽取部分液体涂片后进行革兰染色，记录血培养瓶中待测菌的种类及革兰染色分类。

1.2.2传统血培养鉴定法 根据涂片结果，将阳性标本转种相应培养基，并-80 ℃保存。试验菌株从冰箱取出划线接种于哥伦比亚羊血琼脂平皿上， 37°C 培养 18～24 h， 生长成单个菌落用无菌枪头挑取单个菌落均匀涂抹在靶板上，每孔加70%甲酸1 µL，待晾干后每孔加基质液1 µL，采用MALDI-TOF MS进行鉴定。

1.2.3MALDI SepsityperTMKit方法 参考该试剂盒说明书进行操作，蛋白提取后，输入菌株信息，采集菌株质谱数据，利用软件Biotyper 3.0将人工采集到的图谱与数据库中的图谱进行比对和结果分析，鉴定菌种，记录质谱评分前2种非重复菌种的鉴定结果。

1.2.4血清分离胶促凝管法 直接鉴定方法将500 µL无菌水加入到1.5 mL的离心管中备用；消毒阳性瓶口，抽取混匀的5 mL血培养瓶内容物至BD分离胶促凝管，3 000 r/min离心10 min。用1 µL一次性接种环挑取上述步骤得到的灰白色菌体富集物加入到无菌水500 µL中，13 000 r/min，离心2 min；用无菌吸管吸取上清液弃去，加入无菌水500 µL悬浮并充分振荡混匀，13 000 r/min，离心2 min；重复上一步骤；弃去上清液，加入无水乙醇700 µL悬浮并震荡混匀，13 000 r/min，离心2 min；用移液枪将上清液（乙醇）吸取并弃去，13 000 r/min，离心2 min；室温开盖放置数分钟晾干去除乙醇（残留的乙醇会影响质谱峰，故尽量完全干燥）；向晾干的离心管中加入70%甲酸30 µL震荡混匀，再加入乙腈30 µL，13 000 r/ min，离心2 min；取离心后的上清液1 µL点样至金属靶板并室温晾干。待干燥后加入基质液1 µL，输入菌株信息，采集菌株质谱数据，利用软件Biotyper3.0将人工采集到的图谱与数据库中的图谱进行比对和结果分析，鉴定菌种，记录质谱评分前 2 种非重复菌种的鉴定结果。

1.2.5基因测序法 对于两种前处理方法导致的质谱鉴定结果与纯菌落质谱结果不相符的菌株采用16S rRNA测序法进行最终确认。采用天根生化试剂盒提取细菌DNA，提取的DNA作为模板待用。细菌鉴定采用16 S rRNA 序列测定法进行分子鉴定（引物：F， 5'-AGAGTTTGATGATGGCTCAG-3'；R， 5'-ACCGCAACTGCTGGCAC-3'）真菌采用 18 S rRNA序列测定法进行分子鉴定（引物：F， 5'-GATACCGTCGTAGTCTTA-3'；R， 5'-ATTCCTCGTT GAAGAGC-3'），PCR 扩增条件为 ：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，32 个循环 ；72 ℃延伸 10 min。产物经1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。将PCR产物送铂尚生物技术（上海）有限公司测序，所得序列在NCBI进行比对。

1.2.6统计学分析 根据MALDI-TOF MS鉴定软件设置的鉴定Cutoff值标准，对于纯分单个菌落，得分在2.0以上完全可以鉴定到种的水平；得分在1.7～2.0，可能鉴定到属水平；得分1.7以下，鉴定不准确。根据相关文献[6-8]，我们选取了修正Cutoff值来评估两种方法的有效性，修正Cutoff-2值标准为≥1.8鉴定到“种”水平，介于1.8～1.6鉴定到“属”水平，得分1.6以下结果不可信。同时参考本次实验结果提出修正Cutoff-3值标准：≥1.8鉴定到“种”水平，介于1.8～1.6鉴定到“属”水平，如果得分≤1.6，但鉴定结果前3位均属于同一种菌也认为鉴定正确，否则鉴定不可靠。两种方法鉴定正确率的比较采用卡方检验。

2 结果

2.1 两种前处理方法总准确率比较

本次共收集非重复的血培养阳性标本138份，排除6个假阳性血瓶，鉴定出的病原菌包括革兰阴性菌 70株（53.03%）、革兰阳性菌 57 株（43.18%） 、真菌3株和2例复数菌。按照经典Cutoff值 即Cutoff-1标 准：MALDI SepsityperTMKit 和分离胶促凝管两种前处理方法对血培养快速鉴定病原菌准确率分别为87.88%和71.97%，种鉴定准确率分别为68.18%和43.18%；属鉴定的准确率（排除种鉴定准确的标本，以下均按该方法计算）为19.70%和28.79%；未鉴定率分别为12.12%和28.03%。MALDI SepsityperTMKit鉴 定的准确率略高于血清分离胶促凝管法，差异无统计学意义（87.88% 对71.97%，P＞0.05）。按照修正的Cutoff-2标准，MALDI SepsityperTMKit 和血清分离胶促凝管法对血培养快速鉴定病原菌准确率分别为90.15%和76.52%；种鉴定准确率分别为83.33%和61.36%；属鉴定的准确率为6.82%和15.15%；未鉴定率分别为9.85%和23.48%。在该水平上，MALDI SepsityperTMKit 与血清分离胶促凝管法相比有较高的准确率，差异同样无统计学意义（95.45%对76.52%，P＞0.05）。按照修正的Cutoff-3标准MALDI SepsityperTMKit 和血清分离胶促凝管法对血培养快速鉴定病原菌准确率分别为91.67%和84.09%；种鉴定准确率分别为83.33%和61.36%，与Cutoff-2标准相同，但是属鉴定准确率提高为8.33%和22.73%，未鉴定率降低到8.33%和15.91%，两种方法在该水平上同样差异无统计学意义（P＞0.05）。结果见图1。3种判断水平上，两种前处理方法准确率在统计学无明显差异， SepsityperTMKit鉴定的准确率均略高于血清分离胶促凝管法。在Cutoff-3判断标准下，两种方法均有较高的准确率，因此我们将Cutoff-3作为本次实验的判断标准。

2.2 两种前处理方法鉴定不同革兰阴性菌的比较

本次收集革兰阴性菌70株，不同细菌的鉴定结果见表1。 MALDI SepsityperTMKit 和分离胶促凝管法对血培养快速鉴定革兰阴性菌准确率分别为98.57%和 95.71%，前者鉴定率稍高，但差异无统计学意义（P＞0.05）。两种前处理方法对临床感染常见的革兰阴性病原菌如大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌均有很高的鉴定准确率。

2.3 两种前处理方法鉴定不同革兰阳性菌的比较

本次收集革兰阳性菌57株，不同细菌鉴定结果见表2。 MALDI SepsityperTMKit 和分离胶促凝管法对血培养快速鉴定革兰阳性菌准确率分别为87.72%和78.59%，前者正确率稍高，但两者差异无统计学意义（P＞0.05）。两种前处理方法鉴定临床上常见的革兰阳性病原菌如金黄色葡萄球菌、肠球菌属均有较高的正确率，而对感染较为少见的棒状杆菌属的鉴定准确率较低。

无论选择MALDI SepsityperTMKit 或血清分离胶促凝管法进行前处理，MALDI-TOF MS直接鉴定血培养阳性革兰阴性菌的鉴定准确率均高于革兰阳性菌，分别为98.57%对87.72%， 95.71%对78.59%。

图1 MALDI SepsityperTMKit 和血清分离胶促凝管法两种前处理方法对阳性血培养快速鉴定微生物的比较Figure 1 MALDI-TOF MS rapid identi fi cation of microorganisms in a blood culture system using two pretreatment methods（Sepsityper™ kit and serum separator tube）

表1 MALDI SepsityperTMKit 和血清分离胶促凝管法对血培养阳性MALDI-TOF MS鉴定革兰阴性菌的比较Table 1 MALDI-TOF MS identi fi cation of gram-negative bacteria following pretreatment with SepsityperTMkit and serum separator tube[n（%）]

2.4 真菌和复数菌

本次研究中，只有3株真菌，MALDI SepsityperTMKit鉴定正确2株，血清分离胶促凝管法均未鉴定出。2例复数菌感染，1例为大肠埃希菌和肠球菌混合感染，两种方法均鉴定正确，另1例为热带念珠菌和屎肠球菌感染，两种方法均未鉴定出。

3 讨论

血流感染是一种非常严重的全身感染性疾病，有研究显示，每推迟1 h使用抗生素进行合理治疗，患者的存活率下降7.6%[9]。MALDI-TOF MS是近年来新兴的细菌鉴定技术，其鉴定快速，因此有研究人员将其应用到血培养阳性的鉴定中，极大地缩短了鉴定时间。血培养阳性标本的前处理对鉴定起到了至关重要的作用。Kok等[10]发现，MALDI SepsityperTMKit联合MALDI-TOF MS，可将血培养阳性标本鉴定时间缩短至1 h，而本实验室也在前期实验中探索出一种血清分离胶促凝管法的前处理方法。我们以传统培养出纯菌落再进行质谱鉴定的方法作为金标准，以评估两种前处理方法的效果。

表2 MALDI SepsityperTMKit 和血清分离胶促凝管法对血培养阳性MALDI-TOF MS鉴定革兰阳性菌的比较Table 2 MALDI-TOF MS identi fi cation of gram-positive bacteria following pretreatment with SepsityperTMkit and serum separator tube[n（%）]

血培养瓶中存在红细胞、白细胞等物质，可能会干扰微生物的质谱峰，因此采用质谱仪直接鉴定血培养阳性的微生物需调整质谱评分标准[11]。多宗文献表明[12-14]，根据血培养中微生物的提取方法与实验室环境的不同，其Cutoff值可降低至1.50～1.70。因此我们采取了两种修订的Cutoff值。通过比较发现，依据Cutoff-3值标准（≥1.8鉴定到“种”水平，介于1.8～1.6鉴定到“属”水平，如果得分≤1.6，但鉴定结果前3位均属于同一种菌也认为鉴定正确，否则鉴定不可靠），MALDI SepsityperTMKit和血清分离胶促凝管法均有很高的鉴定准确率，因此我们选择Cutoff-3值作为本实验室的质谱评分标准。国内也有实验室根据自身特点制定了适合自己的实验室评分标准，如李媛睿等[15]将病原菌种属质谱评分标准定为1.50和1.45。

与传统培养方法相比，两种前处理方法联合MALDI-TOF MS有共同的优点：操作简单，直接提取，将鉴定结果的反馈时间缩短了至少2 d。但这两种前处理方法又有各自的优缺点。国外实验室多采用厂商推荐的科研用Sepsityper配套试剂盒，但成本过高，处理时间平均40 min/样本[16]； 血清分离胶促凝管法整个过程仅需约25 min/样本的处理时间，且分离胶促凝管作为耗材在各医疗机构使用广泛，成本低廉、实用性强。SepsityperTMKit鉴定的准确率略高于血清分离胶促凝管法（91.67%对84.09%），但无明显的统计学差异。在真菌鉴定方面，由于本次纳入菌数少，很难推断两种方法的准确性，而且不同真菌的血流感染治疗选择的药物不同[17]，真菌引起的血流感染更为严重[18-19]，如何提高MALDI-TOF MS直接鉴定血培养阳性标本中真菌准确率，也是亟需解决的一个问题，这也为我们以后的研究提供了方向。

MALDI SepsityperTMKit和血清分离胶促凝管法两种前处理方法均可以用于MALDI-TOF MS直接鉴定血培养阳性标本，与前者相比，后者是一种快速、易获得、低廉的MALDI-TOF MS直接鉴定血培养病原菌的前处理方法。实验室也可以依据自身特点和数据建立自己的质谱评分标准，选择合适的前处理方法，从而快速准确地将结果反馈临床，指导临床抗生素的合理使用。

[1] ADHIKARI NK， FOWLER RA， BHAGWANJEE S， et al.Critical care and the global burden of critical illness in adults[J].Lancet， 2010， 376（9749）： 1339-1346.

[2] 李光辉，朱德妹，汪复，等. 2012年中国CHINET血培养临床分离菌的分布及耐药性[J]. 中国感染与化疗杂志，2014，14（6）：474-481.

[3] CHERKAOUI A， HIBBS J， EMONET S， et al. Comparison of two matrix-assisted laser desorption ionization-time of fl ight mass spectrometry methods with conventional phenotypic identi fi cation for routine identi fi cation of bacteria to the species level[J]. J Clin Microbiol， 2010， 48（4）： 1169-1175.

[4] BIZZINI A， JATON K， ROMO D， et al. Matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry as an alternative to 16S rRNA gene sequencing for identification of dif fi cult-to-identify bacterial strains[J]. J Clin Microbiol， 2011，49（2）： 693-696.

[5] GAILLOT O， BLONDIAUX N， LOIEZ C， et al. Costeffectiveness of switch to matrix-assisted laser desorption ionization-time of fl ight mass spectrometry for routine bacterial identi fi cation[J]. J Clin Microbiol， 2011， 49（12）： 4412.

[6] PROD'HOM G， BIZZINI A， DURUSSEL C， et al. Matrixassisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for direct bacterial identification from positive blood culture pellets[J]. J Clin Microbiol， 2010， 48（4）： 1481-1483.

[7] MACHEN A， DRAKE T， WANG YF. Same day identi fi cation and full panel antimicrobial susceptibility testing of bacteria from positive blood culture bottles made possible by a combined lysisfi ltration method with MALDI-TOF VITEK mass spectrometry and the VITEK2 system[J]. PLoS One， 2014， 9（2）： e87870.

[8] MORGENTHALER NG， KOSTRZEWA M. Rapid identi fi cation of pathogens in positive blood culture of patients with sepsis：review and meta-analysis of the performance of the Sepsityper kit[J]. Int J Microbiol， 2015 ： 827416.

[9] IBRAHIM EH， SHERMAN G， WARD S， et al. The in fl uence of inadequate antimicrobial treatment of bloodstream infections on patient outcomes in the ICU setting[J]. Chest， 2000， 11（81）：146-155.

[10] KOK J， THOMAS LC， OLMA T， et al. Identification of bacteria in blood culture broths using matrix-assisted laser desorption-ionization Sepsityper and time of flight mass spectrometry[J]. PLoS One， 2011， 6（8）： e23285.

[11] KLEIN S， ZIMMERMANN S， KOHLER C， et al. Integration of matrix-assisted laser desorption/ionization time-of- fl ight mass spectrometry in blood culture diagnostics： a fast and effective approach[J]. J Med Microbiol， 2012， 61（Pt 3）： 323-331.

[12] SCHIEFFER KM， TAN KE， STAMPER PD， et al. Multicenter evaluation of the Sepsityper extraction kit and MALDI-TOF MS for direct identi fi cation of positive blood culture isolates using the BD BACTEC FX and VersaTREK（（R）） diagnostic blood culture systems[J]. J Appl Microbiol， 2014， 116（4）： 934-941.

[13] CHRISTNER M， ROHDE H， WOLTERS M， et al. Rapid identi fi cation of bacteria from positive blood culture bottles by use of matrix-assisted laser desorption-ionization time of fl ight mass spectrometry fi ngerprinting[J]. J Clin Microbiol， 2010， 48（5）： 1584-1591.

[14] MEEX C， NEUVILLE F， DESCY J， et al. Direct identi fi cation of bacteria from BacT/ALERT anaerobic positive blood cultures by MALDI-TOF MS： MALDI Sepsityper kit versus an in-house saponin method for bacterial extraction[J]. J Med Microbiol，2012， 61（Pt 11）： 1511-1516.

[15] 李媛睿，俞静， 刘靖娴，等.应用MSK试剂盒-质谱法直接鉴定阳性血培养标本[J]. 上海交通大学学报（医学版），2016，36（2）：256-263.

[16] MARTINY D， DEDISTE A， VANDENBERG O. Comparison of an in-house method and the commercial Sepsityper kit for bacterial identi fi cation directly from positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption-ionisation time-of- fl ight mass spectrometry[J]. Eur J Clin Microbiol Infect Dis， 2012， 31（9）：2269-2281.

[17] ORASCH C， MARCHETTI O， GARBINO J， et al. Candida species distribution and antifungal susceptibility testing according to European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing and new vs. old Clinical and Laboratory Standards Institute clinical breakpoints： a 6-year prospective candidaemia survey from the fungal infection network of Switzerland[J]. Clin Microbiol Infect， 2014， 20（7）： 698-705.

[18] HARBARTH S， FERRIERE K， HUGONNET S， et al.Epidemiology and prognostic deter minants of bloodstream infections in surgical intensive care[J]. Arch Surg， 2002， 137（12）： 1353-1359.

[19] LORTHOLARY O， RENAUDAT C， SITBON K， et al.Worrisome trends in incidence and mortality of candidemia in intensive care units （Paris area， 2002-2010）[J]. Intensive Care Med， 2014， 40（9）： 1303-1312.

Performance assessment of MALDI Sepsityper™ kit and serum separator tube as pretreatment methods for direct identi fication of microorganisms from blood cultures using MALDI-TOF mass spectrometry

QIN Juanxiu, HUANG Qian, GAO Qianqian, XIE Yihui, LI Min, ZHANG Haomin. （Department of Laboratory Medicine, Renji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200127, China）

R378

A

1009-7708 ( 2017 ) 05-0546-06

10.16718/j.1009-7708.2017.05.012

2017-01-17

2017-04-17

上海交通大学医学院附属仁济医院检验科，上海 200127。

秦娟秀（1989—）﹐女﹐硕士研究生﹐初级检验师﹐主要从事病原微生物的致病机制研究。

张灏旻﹐E-mail：zhanghaomin1976@163.com。