气相色谱法测定铁皮石斛、浙贝母和人参中嘧菌酯残留

范丽丽， 王 娟， 吴加伦

(农业部植物病原及昆虫分子生物学重点实验室，浙江大学农药与环境毒理研究所，浙江杭州 310058)

嘧菌酯(Azoxystrobin)是先正达公司开发的甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂，具有高效、广谱、低毒等特点，对白粉病、霜霉病等数十种真菌性病害均有良好的活性[1]。嘧菌酯与目前已有的其他类别杀菌剂无交互抗性，近年来已发展为极具潜力和市场活力的新型农用杀菌剂[2]。

铁皮石斛、浙贝母和人参均收录于历版《中国药典》一部[3]中，具有独特的疗效，在人类健康上起到很重要的作用。姚晓明等[4]针对浙江省中药材的农药使用情况进行了调查，发现其农药品种高达80多种，其中嘧菌酯是检出率较高的农药之一，因此嘧菌酯在中药材中的残留成为人们关注的焦点问题。目前，国内外已有较多有关嘧菌酯残留检测的报道，但主要是针对水果、蔬菜以及粮食作物等基质[5,10]，而关于中药材中嘧菌酯残留的研究较少，仅有人参的相关报道[11 - 12]。本研究旨在建立铁皮石斛、浙贝母和人参中嘧菌酯的气相色谱-电子捕获检测器(GC-ECD)残留分析方法，在易于操作和适用的基础上均满足残留分析的要求，同时更好的保障中药材的食用安全，促进其国际化贸易。

1 材料与方法

1.1 主要仪器、试剂与材料

7890A气相色谱仪(美国，Agilent公司)，配电子捕获检测器(ECD)；KQ5200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；SHB-III-B循环水式抽滤装置(杭州大卫科教仪器有限公司)；Heidolph Laborota 4010 digital旋转蒸发仪(德国，Heidolph集团)；MNT-5800氮吹仪(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)。

嘧菌酯(Azoxystrobin)标准品(纯度99.5%，迪马科技有限公司)。准确称取嘧菌酯标准品0.0101 g(精确到0.0001 g)，用乙酸乙酯配制成质量浓度为100.0 mg/L的标准贮备溶液，保存于-20 ℃冰箱中，实验时用乙酸乙酯稀释成0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0和5.0 mg/L系列浓度标准工作溶液，于4 ℃冰箱保存，备用。乙腈、二氯甲烷、正己烷、NaCl、无水Na2SO4均为分析纯；乙酸乙酯为色谱纯，用前经过全玻璃蒸馏装置重蒸；弗罗里硅土(粒径150～250 μm，国药集团化学试剂有限公司)，中性Al2O3(粒径75～150 μm，国药集团化学试剂有限公司)，两者均经600 ℃灼烧4 h，用前于130 ℃烘2 h后，加3%的水脱活；活性炭(分析纯，浓HCl中加热煮沸1 h，用水洗至中性，烘干后在600 ℃灼烧2 h)。

铁皮石斛样品购于浙江寿仙谷医药股份有限公司(经检测不含嘧菌酯)；人参及浙贝母样品购于浙江省磐安药材市场(经检测不含嘧菌酯)，样品用中药粉碎机粉碎、混匀，装入聚乙烯塑料袋，于-20 ℃贮存，备用。

1.2 实验方法

1.2.1提取称取已粉碎的干中药材粉末5.00 g(铁皮石斛干粉2.00 g)，精确至0.01 g，置于250 mL带螺纹盖样品瓶中，准确加入10 mL水，摇匀后旋紧螺纹盖，静置10 min后，再加入50 mL乙腈，超声提取30 min，提取液经布氏漏斗抽滤，并用30 mL乙腈洗涤残渣，合并滤液于平底烧瓶中，经旋转蒸发仪浓缩。将浓缩液转移到盛有50 mL 10%的NaCl溶液的250 mL分液漏斗中，分别用40 mL二氯甲烷振荡萃取两次，经无水Na2SO4脱水后收集有机相，旋转蒸发浓缩至近干，氮吹仪吹干，5 mL正己烷溶解，待层析柱净化。

1.2.2净化层析柱从下往上依次是2 cm无水Na2SO4，1 g弗罗里硅土，5 g中性Al2O3混合物(铁皮石斛样品需再加入0.1 g活性炭)，2 cm无水Na2SO4，均匀敲实。首先用15 mL的二氯甲烷∶乙酸乙酯(9∶1，V/V)和15 mL二氯甲烷预淋洗，待液面接近上层无水Na2SO4底部时，立刻加入上述溶解液，再依次加入20 mL正己烷、30 mL二氯甲烷淋洗，均弃去以上淋出液，最后用80 mL二氯甲烷∶乙酸乙酯(9∶1，V/V) 混合溶液洗脱，收集全部洗脱液于250 mL平底烧瓶中，旋转蒸发仪浓缩至近干，氮吹仪吹干，乙酸乙酯定容至5 mL(铁皮石斛定容至2 mL)，过0.22 μm滤膜，待GC-ECD检测。

1.3 气相色谱条件

色谱柱为DB-5毛细管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm，Agilent Technologies SN123-5032)；进样口温度280 ℃；检测器温度325 ℃；程序升温:初始100 ℃保持1 min，以50 ℃/min升至200 ℃保持1 min，再以25 ℃/min升至270 ℃保持3 min，最后以再以5 ℃/min升至290 ℃保持15 min；载气为高纯氮气，流速1.0 mL/min；尾吹气流量30.0 mL/min；进样量为1 μL，不分流进样。采用保留时间定性，基质外标法定量。

2 结果与讨论

2.1 检测方法的选择

嘧菌酯的残留检测方法主要有气相色谱法(GC)[5 - 6]、高效液相色谱法(HPLC)[7]、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)[8 - 9]和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[12]。采用GC-MS和LC-MS/MS等检测方法虽然既可定性又可定量，但仪器昂贵，不利于方法的推广使用。而GC-ECD作为嘧菌酯常用的检测手段，仪器成本低，操作技术简单，是一种可以被广泛推广的检测手段。且从三种中药材样品色谱图(图1)可以看出，目标峰与杂质完全分离，不影响其定性分析的准确性，其检测灵敏度高，稳定性好，故本研究选用GC-ECD法进行嘧菌酯的检测。

图1 嘧菌酯在不同基质中的色谱图Fig.1 Chromatograms of azoxystrobin in different matrices A:Chromatograms of ethyl acetate(a) and 0.1 mg/kg standard solution of azoxystrobin(b);B:Blank fritillaria thunbergii sample(a) and spiked fritillaria thunbergii sample at 0.1 mg/kg(b);C:Blank dendrobium candidum sample(a) and spiked dendrobium candidum sample at 0.1 mg/kg(b);D:Blank panax ginseng sample(a) and spiked panax ginsengsample at 0.1 mg/kg(b).

2.2 前处理条件的选择

2.2.1提取溶剂的选择基于嘧菌酯的在各种溶剂中的溶解度[1]，本研究比较了乙腈、丙酮两种溶剂的提取效果。结果发现，两者回收率均在80%以上，其中丙酮的提取回收率相对较高，但同时提取出色素等多种杂质，给后续净化增加难度；而乙腈作为提取溶剂，对样品基质中的蜡类和脂肪和一些亲脂性色素的提取能力较弱，能够有效地减少提取液中杂质。由于中药材干粉样品细胞多处于干瘪状态，农药提取效果差，在提取时先加入一定量的水，有利于提高农药的提取效果。因此提取时先加入10 mL水，静置10 min后，再加入50 mL乙腈超声提取，对三种中药材基质提取效果最佳。

2.2.2净化方法的选择嘧菌酯的净化方法主要有固相萃取(SPE)[5 - 6]、层析柱净化[11 - 12]以及QuEchERS法[13]。本研究用乙腈作为提取剂，对这三种净化方法的提取效果和回收率进行了比较。结果表明，三种净化方法均满足对嘧菌酯回收率的要求，但由于中药材的成分较为复杂，固相萃取和QuEchERS法净化，杂质和目标峰并不能达到有效分离，而层析柱净化可以达到很好的分离效果(图1)。故本研究选择柱层析对这三种中药材进行净化。

图2 嘧菌酯在铁皮石斛、浙贝母和人参中不同层析柱填料的净化效果(添加水平为0.1 mg/kg，n=3)Fig.2 Effect of different column chromatography for azoxystrobin in dendrobium officinale,fritillaria thunbergii and panax ginseng at the 0.1 mg/kg level(n=3)

2.2.3层析柱填料选择实验比较了不同层析柱填料的净化效果，结果(图2)显示，活性炭层析柱净化效果较好，但对嘧菌酯有一定的吸附性；单一弗罗里硅土和中性Al2O3作为填料时，回收率均能满足要求，但净化效果较差；而1 g弗罗里硅土和5 g中性Al2O3混合后作为层析柱填料时，嘧菌酯在三种中药材基质均能达到较好的分离和净化效果。由于铁皮石斛样品中色素含量较高，容易污染检测系统，在相同净化方法的基础上尝试加入0.1 g活性炭作为层析柱填料处理，发现可更好地去除色素等杂质的同时，满足回收率的要求。

2.2.4淋洗溶剂的选择由于铁皮石斛、浙贝母和人参成分的复杂性，对层析柱淋洗剂的选择较为繁琐。为了消除基质中共提组分对待测物的干扰，样品提取液经过层析柱后，分别采用一定体积的正己烷和二氯甲烷实验，结果发现20 mL正己烷和30 mL二氯甲烷淋洗能有效地去除干扰杂质(图1)，且不影响回收率。去除杂质后用30 mL、30 mL、20 mL、10 mL、10 mL二氯甲烷∶乙酸乙酯(9∶1，V/V)洗脱，分段收集，GC-ECD法检测。结果发现，在最后20 mL洗脱液中未检测到嘧菌酯，由此确定二氯甲烷∶乙酸乙酯(9∶1，V/V)洗脱液的用量为80 mL。

2.3 基质效应

Poole等[13]的研究表明，采用气相色谱法测定农药残留时，待测农药极易受到样品基质效应的影响。本实验配制了一系列浓度标准溶液和基质匹配标准溶液，采用基质匹配标准溶液线性的斜率与溶剂标准溶液的线性斜率相比较，其增加或减少的百分比来评价基质效应。如果基质效应的值在±10%范围内，基质效应可以被忽略；否则被认为存在一定的基质效应[14]。从表1中可以发现，在3种中药材基质中均有明显的信号增强效应。故在用外标法定量时，采用空白基质提取液配制标准溶液，以消除基质干扰，提高检测结果的准确性。

2.4 线性关系、检出限及定量限

分别取铁皮石斛、浙贝母和人参空白样品，按1.2节的方法前处理，用上清液代替乙酸乙酯作为溶剂，配制成嘧菌酯质量浓度分别为0.01、0.05、0.1、0.5 和1.0 mg/L的基质匹配系列标准溶液，在1.3节条件下测定，以各标准溶液的质量浓度(x，mg/L)为横坐标、相应的色谱峰面积(y)为纵坐标分别进行线性回归。结果表明，在0.01～1 mg/kg范围内，嘧菌酯峰面积与其质量浓度呈良好的线性关系，相关系数均大于0.999。分别以最小添加水平色谱图中信噪比的3倍确定其检出限(LOD)，以最小添加水平确定其定量限(LOQ)，结果见表1。

表1 嘧菌酯在不同基质中的线性关系、基质效应、检出限和定量限

Matrix effect(%)=((slope matrix/slope solvent)-1)×100.

2.5 方法的准确度和精密度

选取不含嘧菌酯的铁皮石斛、浙贝母和人参空白样品，分别添加0.01、0.1和0.5 mg/kg的三个水平的嘧菌酯标准溶液，按照1.2节方法前处理和1.3节的条件测定，基质外标法定量，每个水平批内重复5次，批间重复3次，计算方法的准确度和精密度。实验结果表明:在0.01、0.1和0.5 mg/kg的添加水平下，嘧菌酯在3种中药材基质中平均回收率为85.0%～94.9%，日内相对标准偏差(RSD)为1.1%～5.2%(n=5)，日间相对标准偏差(RSD)为4.0%～6.7%(n=15)，结果见表2，均符合农药残留检测要求[15]。

表2 嘧菌酯在3种不同基质中的平均添加回收率和相对标准偏差

3 结论

本研究建立了铁皮石斛、浙贝母和人参中同时适用的嘧菌酯的残留分析方法。该方法嘧菌酯和杂质峰均能够完全分离，所用装置简单，易于操作，灵敏度高，重现性好，且准确度和精密度均满足农药残留分析标准。为铁皮石斛、浙贝母和人参三种重要中药材中嘧菌酯残留的监控提供了有效的检测方法，从而有效的从源头控制其农药残留问题,对中药材的食用安全以及出口贸易有重要意义,也为其它中药材中嘧菌酯的残留分析提供一定的参考。