二氢杨梅素对2型糖尿病小鼠认知功能障碍的影响*

朱责梅， 阳际花， 杨丝丝， 何剑琴， 张恺芳， 奉水东， 凌宏艳Δ

(1. 常德职业技术学院医学系， 湖南 常德 415003； 2. 南华大学生理学教研室，3. 南华大学社会医学与卫生事业管理学教研室， 湖南 衡阳 421001)

二氢杨梅素对2型糖尿病小鼠认知功能障碍的影响*

朱责梅1,2， 阳际花2+， 杨丝丝2， 何剑琴2， 张恺芳2， 奉水东3Δ， 凌宏艳2Δ

(1. 常德职业技术学院医学系， 湖南 常德 415003； 2. 南华大学生理学教研室，3. 南华大学社会医学与卫生事业管理学教研室， 湖南 衡阳 421001)

目的观察二氢杨梅素(DHM)对2型糖尿病(T2DM)小鼠认知功能障碍及海马中BDNF蛋白表达的影响。方法将40只C57BL/6J小鼠首先随机分为两组：正常对照组(n=8)：普通饲料喂养；2型糖尿病模型组(n=32)：高糖高脂联合100 mg/kg的STZ处理(造模过程中死亡5只，不成功3只)。24只建模成功的小鼠随机分成3组：T2DM组、T2DM+L-DHM组和T2DM+H-DHM组，3组小鼠高糖高脂喂养，同时分别用等体积生理盐水、125 mg/(kg·d) 的DHM和250 mg/(kg·d) 的DHM(1次/天，灌胃)处理16周。正常对照小鼠继续普通饲料喂养，同时用等体积生理盐水(1次/天，灌胃)处理16周。16周后测定小鼠体重、空腹血糖、进行腹腔注射葡萄糖耐量实验和相关行为学实验。最后，Western blot检测各组小鼠海马中BDNF蛋白的表达。结果高糖高脂联合100 mg/kg的STZ成功建立2型糖尿病小鼠模型。16周后，与正常对照组相比，T2DM组小鼠体重明显下降，空腹血糖显著升高，糖耐量显著异常；而T2DM+DHM组相比T2DM组小鼠体重却显著增加、空腹血糖降低，且H-DHM可显著改善T2DM小鼠糖耐量异常。行为学实验结果显示：与正常对照组相比，T2DM组小鼠学习记忆能力明显下降；与T2DM组相比，T2DM+DHM组小鼠学习记忆能力得到改善，且H-DHM组更为明显。Western blot结果显示：与对照组相比，T2DM组小鼠海马中BDNF蛋白表达显著下降，而DHM组相比T2DM组小鼠其BDNF蛋白的表达明显增加。结论二氢杨梅素可改善2型糖尿病小鼠认知功能障碍，其机制可能通过降血糖作用，并激活海马中BDNF蛋白表达。

二氢杨梅素；2型糖尿病；小鼠；认知功能障碍；BDNF

糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢紊乱综合征，常伴视网膜病变、肾病、周围神经病变、大血管疾病等严重并发症，近年来，大量研究证实糖尿病亦可累及中枢神经系统，导致认知功能障碍，重者甚至可发展为痴呆[1-2]。糖尿病引起的认知障碍(diabetic cognitive impairment, DCI)主要表现在语义记忆，情景记忆，工作记忆，视觉空间能力，语言流畅度，知觉能力等受损[3]。研究显示：高血糖、氧化应激、炎症、海马突触可塑性改变、神经元钙稳态的破坏、脑微血管损伤及脑内胰岛素信号通路的异常等因素均参与DCI的发病过程[4]，但在DCI的防治方面并不乐观。因此，深入研究DCI的发病机制、探讨其防治的新靶点，具有重要的临床和社会意义。

植物黄酮类化合物普遍具有抗炎抗氧化，保护心血管等作用，也有文献证实黄酮类化合物可改善认知功能、提高学习记忆等[5]。而二氢杨梅素(dihydromyricetin, DHM) 就是典型的黄酮类化合物，已有研究表明，DHM可降低四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖，改善D-半乳糖诱导的大鼠糖耐量异常，降低糖尿病大鼠血糖血脂[6-7]；李石飞等[8]报道二氢杨梅素能改善经高糖、高胰岛素处理后L6肌管细胞的胰岛素抵抗；也有研究表明二氢杨梅素可改善阿尔茨海默症大鼠的认知功能障碍[9]，改善缺血导致的学习和记忆缺陷[10]。这些研究提示：DHM对胰岛素抵抗、糖尿病等代谢相关疾病具有防治作用，但DHM是否对糖尿病认知障碍具改善作用以及其机制探讨目前尚不清楚。

1 材料与方法

1.1 实验动物

C57BL/6J雄性小鼠，4周龄，体重18～19 g，由常州卡文斯实验动物有限公司提供，动物使用许可证号：SCXK(苏)2011-0003。小鼠在动物房(三或四只为一笼)适应性喂养一周后，正式实验。每天晚上七点给小鼠投放鼠粮及更换饮水。动物房早晨六点至晚上六点为明，晚上六点至早晨六点为暗；环境温度22℃～24℃、湿度40%～60%；保持充足的饲料及饮水(除测血糖，行为学测试等实验时间外)。实验操作遵照美国国立卫生研究院NIH的《国家实验动物健康与管理条例》进行。

1.2 主要实验试剂和设备

二氢杨梅素(DHM)由中国科学院武汉植物研究所提供、链脲佐菌素 (STZ)购自美国Sigma、抗BDNF抗体购于上海碧云天生物公司；血糖仪(JPST-5)购于北京怡成生物电子技术有限公司、Y迷宫设备购自成都泰盟软件有限公司、通用自发活动箱 购自上海吉量软件科技公司、WMT-200水迷宫视频跟踪分析系统购于成都泰盟软件有限公司。

1.3 2型糖尿病模型建立及实验分组

四周龄雄性C57BL/6J小鼠40只，分笼适应性喂养1周，随机选出8只作为正常对照组普通饲料喂养，其余小鼠为2型糖尿病模型(T2DM组,共32只)：高糖高脂饲料喂养。1月后，所有小鼠过夜禁食14 h，正常对照组小鼠给予柠檬酸缓冲液(pH 4.4) 100 mg/kg 腹腔注射，模型组小鼠给予1%STZ按 100 mg/kg 腹腔注射(每日 1 次，连续 3 日，死亡8只)，3 d后尾静脉取血，用仪成血糖仪测定空腹血糖，如空腹血糖≥11.1 mmol/L，认为2型糖尿病小鼠模型建立成功。随后，T2DM模型小鼠随机分成3组(每组8只)： T2DM组、T2DM+L-DHM组和T2DM+H-DHM组。3组小鼠高糖高脂喂养，同时分别用等体积生理盐水、125 mg/(kg·d) 的二氢杨梅素和250 mg/(kg·d) 的二氢杨梅素(1次/天，灌胃)处理16周。16周末称重、测空腹血糖，随后每组随机选3只小鼠进行糖耐量实验，剩余小鼠进行Y迷宫实验。17周末进行新物体识别实验，18周末进行水迷宫实验。行为学实验结束后，取海马组织。

1.4 糖耐量实验

小鼠过夜禁食12 h后，按照1 g/kg剂量腹腔注射10%葡萄糖溶液，在0，30，60，90，120 min时分别进行剪尾采血，测血糖。

1.5 行为学实验

Y迷宫实验: 在Y迷宫三臂外侧分别标记A, B, C臂，将小鼠头部朝臂末端放入，开始录像(时长8 min，前3 min为适应阶段，后5 min为测试阶段)，让小鼠在迷宫的三臂间自由活动，记录从第3分钟开始到实验结束之间小鼠入臂的次序，如进入到A臂则记录为A。自发交替指的是小鼠在连续的3次不同探索入臂，最大交替次数即为总入臂次数减去2，Y迷宫的统计值用交替正确率表示，即自发交替率(SA%)， SA%=(自发交替次数÷最大交替次数)×100%。如小鼠入臂次序为ACBACABACBC，入臂总次数为11，自发交替次数为6，SA% = 6/(11-2) ×100 %= 66.7 %。

新物体识别实验: 将小鼠放入自发活动箱并按顺序做好记录，适应5 min后放回鼠笼，24 h后进入训练期。训练阶段—将两个相同的物体(白色玻璃苹果)安置在内箱中使相距10 cm，且两物体位置保持不变，将小鼠面对箱壁、身体与侧壁相平行放入离人最远的箱壁中间位置，关闭箱门，开始录像，小鼠熟悉初始样本物体(约10 min)后，放回鼠笼。经24 h的间隔期后进入测试阶段—将自发活动箱内其中一个原物体用酒精擦拭后放回原位置，另一个替换成新物体(绿色塑料圆柱)。将小鼠按顺序放入活动箱内并录像5 min后放回鼠笼，然后打开录入的视频，用秒表分别计算测试期小鼠探索旧物体 (TF) 和探索新物体 (TN) 的时间，可分为直接或间接接触物体的时间，直接接触包括小鼠嘴，鼻子或者爪子直接碰触物体，不包括小鼠背对着物体，经过物体，站在，坐在或依靠在物体上[11]，间接接触指的是小鼠在鼻子离物体的距离小于或等于2 cm处进行试探行为。最后通过辨别指数(discrimination index, DI)来判断小鼠认知功能，DI = 100*(TN-TF)/(TN+TF)。辨别指数越高，说明小鼠的记忆力越强，认知功能越好。

水迷宫实验：使用水迷宫实验检测小鼠空间记忆能力，本实验在一个单独房间完成，使用一个圆形水池等分为4个扇形象限，在第三象限下放一逃逸平台且位置不变，其顶部距离水面1cm,水温控制在22℃左右。实验连续进行6 d，可视平台训练(第1天)：每只小鼠被放在平台上停留20 s，然后让其自由游泳30 s后再放回平台上休息20 s。隐藏平台训练(第2～5天)：在圆池中注水至高于平台1 cm，并撒入无毒的二氧化钛粉末，搅匀至白色悬浊状隐藏平台，将小鼠面朝池壁从第一象限轻放入水中，60 s内小鼠能发现平台就让其在平台上休息20 s，并记录小鼠找到平台的时间(潜伏期)，若60 s内未找到平台，将小鼠赶到平台上停留20 s后放回鼠笼，潜伏期按60 s 计算。再将小鼠分别从第二、第三、第四象限放入，并确保每只小鼠两轮实验之间相隔时间为15～20 min。连续训练4 d，小鼠找到逃逸平台的潜伏期及游泳距离越小，说明小鼠的空间记忆能力越强。空间探索实验(第6天)：撤除平台，让每只小鼠放入后自由游泳60 s。摄像跟踪记录小鼠经过目标象限(原放平台的象限)的总时间以及游泳轨迹。小鼠穿越平台次数越多，在目标象限所占时间百分比越大，说明小鼠的空间记忆能力越强[12]。

1.6 Western blot检测海马BDNF蛋白表达

取0.25g海马组织，用PBS清洗3遍，加入300 μl RIPA裂解液于匀浆器中反复研磨，低温高速离心机离心 15 min后取上清液装于离心管中备用。然后用BCA蛋白试剂盒测定样品蛋白的浓度。调整各组蛋白浓度相等后，各取等体积样品蛋白进行SDS-PAGE电泳、 转膜、5%脱脂牛奶封闭2 h、加入抗BDNF抗体孵育过夜，TBST洗涤3次，加入辣根过氧化酶标记的二抗孵育2 h，充分洗涤后与ECL化学发光试剂反应，曝光后扫描，用图像分析软件进行光密度分析。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1二氢杨梅素使2型糖尿病小鼠体重增加，血糖降低

如图1所示：与正常对照组相比，T2DM组小鼠体重显著下降，血糖明显升高，提示高糖高脂联合STZ可成功复制出2型糖尿病小鼠模型。与T2DM组相比，T2DM+L-DHM和T2DM+H-DHM组小鼠体重显著增加，血糖显著下降，但T2DM+L-DHM组和T2DM+H-DHM组之间无显著性差异，表明DHM可增加2型糖尿病小鼠体重、降低血糖。

2.2 二氢杨梅素改善2型糖尿病小鼠糖耐量异常

糖耐量实验结果显示：T2DM组小鼠血糖在0、15、30、60、90、120 min均显著高于正常对照组，提示T2DM小鼠糖耐量异常；与T2DM组相比，T2DM+H-DHM组血糖在30、60、90、120 min均显著降低，但仍然高于正常对照组。而T2DM+L-DHM组与T2DM组相比无显著性差异(图2)。提示250 mg/(kg·d)二氢杨梅素可改善T2DM小鼠糖耐量异常。

2.3二氢杨梅素改善2型糖尿病小鼠认知功能障碍

2.3.1 Y迷宫实验 实验结果显示，与对照组相比，T2DM组自发转换率(SA%)显著降低(P<0.01)；与T2DM组相比，T2DM+L-DHM组SA%升高 (P<0.05)，T2DM+H-DHM组SA%进一步升高 (P<0.01) ，提示2型糖尿病小鼠的认知功能发生障碍，而二氢杨梅素可改善2型糖尿病小鼠的认知障碍(图3A)。与对照组相比T2DM组，T2DM+L-DHM组和T2DM+H-DHM组小鼠在5 min内入臂总次数无显著性差异，表明2型糖尿病小鼠运动量无变化，二氢杨梅素对2型糖尿病小鼠的自发运动能力无影响(图3B)。

2.3.2 新物体识别实验 如图4结果显示：四组小鼠总物体探索时间无显著性差异，说明4组小鼠对新旧物体的喜好程度无差异。与对照组相比，T2DM组小鼠新物体辨识指数显著降低；与T2DM组相比，T2DM+L-DHM组和T2DM+H-DHM组小鼠的新物体辨识指数显著升高。表明T2DM小鼠新颖物体识别记忆能力受损，二氢杨梅素可在一定程度上改T2DM小鼠新物体识别记忆能力。

2.3.3 水迷宫实验 如图5A和5B所示：在第1天的可视平台实验中，4组小鼠的逃逸潜伏期及游泳距离没有显著性差异，说明各组小鼠之间视力水平一致。从第2天到第5天的隐藏平台定位航行实验中，T2DM小鼠找到平台的潜伏期及游泳距离均显著高于对照组(P<0.01)； L-DHM和H-DHM可显著缩短T2DM小鼠的潜伏期及游泳距离。在第6天的空间探索实验(图2.5 C和2.5 D)中，T2DM组小鼠穿越平台次数，目标象限停留时间比均显著低于对照组(P<0.01)；T2DM+L-DHM组及T2DM+H-DHM组小鼠穿越平台次数，目标象限停留时间比显著高于T2DM 组(P<0.05，P<0.01)。表明2型糖尿病小鼠空间工作记忆能力下降，不能在短时间内找到逃逸平台，提示二氢杨梅素可改善2型糖尿病小鼠的空间记忆能力，逃避有害刺激。

2.4DHM对2型糖尿病小鼠海马BDNF蛋白表达的影响

Western blot实验结果显示：与对照组相比，T2DM组小鼠海马中BDNF蛋白表达量显著降低(P<0.01)；与T2DM组相比，T2DM+L-DHM组和T2DM+H-DHM组的BDNF蛋白表达量显著性升高。提示低、高剂量二氢杨梅素均可促进T2DM小鼠海马中BDNF蛋白的表达 (图6)。

3 讨论

随着全球经济的迅速增长，人们生活水平的提高及人口老年化日趋严重，糖尿病患病率持续增长，糖尿病引起的认知功能障碍也逐渐被重视。流行病学研究及临床数据表明糖尿病是引发认知功能障碍的独立危险因素，且研究表明糖尿病人患认知功能障碍的风险相对正常人增加20%～60%[13]，同时糖尿病人患阿尔茨海默症[14-15]及抑郁症[16]的风险分别是常人的2～3倍，极大地加速患者认知功能障碍。二氢杨梅素(DHM)为葡萄科藤茶的提取物，活性成分以双氢黄酮类化合物为主，具有降糖、降脂、抗肿瘤等多种药理作用[17]，而高血糖又是导致糖尿病认知功能障碍的主要病因之一。BDNF作为一种神经营养因子，不仅对神经元的发生、发育和存活具有重要调节作用[18]，而且对神经元功能的维持以及神经退行性疾病中的损伤具有保护作用[19-20]。因此，本实验探究DHM对糖尿病认知功能障碍的改善作用，及其与BDNF相关的作用机制。

本实验以4周龄的C57BL/6J雄性小鼠为对象，首先利用STZ联合高糖高脂复制2型糖尿病(T2DM)小鼠模型，每周定期检测小鼠的体重和血糖，16周后小鼠表现有明显的多饮、多食、多尿、消瘦等糖尿病症状，且与正常饲养组小鼠相比活动量明显减少，表明T2DM模型制备成功，并出现认知表现上的差异。于是对小鼠体重、血糖、糖耐量进行测定，结果显示：T2DM模型组与正常组小鼠相比体重下降、血糖显著性升高、糖耐量异常；与T2DM模型组相比，而DHM+T2DM组小鼠的体重有所增加、血糖明显降低、H-DHM组小鼠的糖耐量异常也明显得到改善，表明DHM可改善T2DM小鼠的部分症状。

糖尿病引起的认知缺陷主要表现在情景记忆，语言语义记忆，空间记忆能力等受损。进一步我们对所有实验小鼠进行Y迷宫、新物体识别、水迷宫等行为学检测，结果发现：与正常组比，T2DM模型组小鼠的辨别性学习记忆、新物体识别记忆、空间工作学习能力均下降，而DHM+T2DM组小鼠的这些行为学习能力强于T2DM模型组，且H-DHM组更为明显。结果表明2型糖尿病小鼠出现认知功能障碍(DCI)，且DHM对此T2DM的认知功能障碍具有改善作用。

DCI是一种以学习记忆障碍为主的神经退行性病变， BDNF的减少与DCI的发生发展密切相关。我们采用Western blot方法检测小鼠海马中BDNF蛋白的表达，结果显示：与对照组相比，T2DM组小鼠海马BDNF蛋白表达显著下降， DHM组小鼠海马内BDNF蛋白表达明显高于T2DM模型组，提示DHM可能通过提高T2DM小鼠海马BDNF蛋白的表达改善DCI。

综上所述，我们首次报道DHM可能通过降低T2DM小鼠血糖，提高海马BDNF蛋白的表达来发挥改善2型糖尿病认知功能障碍的作用。然而，DHM是通过何种分子途径激活BDNF蛋白的表达，尚须进一步实验证明。

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Theeffectsofdihydromyricetinoncognitivedysfunctionintype2diabetesmice

ZHU Ze-mei1,2, YANG Ji-hua1+, YANG Si-si1, HE Jian-qin1, ZHANG Kai-fang1, FENG Shui-dong2Δ, LING Hong-yan1Δ

(1. Department of Medicine, Changde Vocational Technical College， Changde 415003; 2. Department of Physiology, University of South China, 3. Department of Social Medicine and Health Service Management , University of South China， Hengyang 421001, China)

Objective: To observe the effects of dihydromyricetin(DHM) on cognitive dysfunction and expression of brain derived neurotrophic factor(BDNF) protein in hippocampus of type 2 diabetic mice(T2DM).MethodsForty C57BL/6J mice were randomly divided into two groups, normal control group (n=8): normal diet feeding; T2DM model group (n=32): high-glucose and high-fat combined with 100 mg/kg streptozocin(STZ) treatment (five mice died during modeling and three failed). Twenty-four diabetic mice were modeled successfully and divided into three groups (T2DM group, T2DM+L-DHM group and T2DM+H-DHM group). Three groups mice were fed with high-glucose and high-fat diet, and treated with equal volume of normal saline, 125 mg/(kg·d) DHM or 250 mg/(kg·d) DHM for 16 weeks respectively. The control mice were fed with normal diet and treated with equal volume of saline (once a day, gavage) for 16 weeks. After 16 weeks, the body weight and fasting blood glucose were measured, intraperitoneal glucose tolerance test and related behavioral experiment were performed. Finally, the expression of BDNF protein in hippocampus of mice was detected by Western blot.ResultsThe model of type 2 diabetes mellitus was established successfully with high-glucose and high-fat combined with 100 mg/kg STZ. After 16 weeks, the body weight of T2DM group was significantly decreased, the fasting blood glucose was significantly increased and the glucose tolerance was significantly abnormal compared with the normal control group. Compared with T2DM group, the body weight of T2DM+DHM groups mice was increased, while the levels of fasting blood glucose were decreased. And H-DHM could significantly improve the abnormal glucose tolerance of T2DM mice. Behavior test results showed that the ability of learning and memory of T2DM mice was significant decreased compared with control group, but these phenomena were improved in T2DM+DHM groups mice, and T2DM+H-DHM group was more obvious. Western blot analysis showed that the expression of BDNF protein in hippocampus of T2DM group was significantly lower than that of control group, while T2DM+DHM group was significant increased compared with T2DM mice.ConclusionDihydromyricetin can improve the cognitive dysfunction in type 2 diabetic mice. The mechanism may be through hypoglycemic effect and activation of BDNF protein expression in hippocampus.

dihydromyricetin; type 2 diabetes; mouse; cognitive impairment; BDNF

R587.2；R 742

A

1000-6834(2017)04-323-06

10.12047/j.cjap.5478.2017.079

教育部留学归国基金(教外司留[2014]1685号)；湖南省科技厅(2015JC3085)；湖南省教育厅课题(16C1411)

2016-07-25

2017-06-16

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Tel: 86-0734-8281389, Tel: 86-0734-8281621； E-mail: linghongyan0203@126.com， E-mail: shuidong_f@hotmail.com;+：为共同第一作者