利用花药培养快速选育广亲和水稻材料

査中萍+杜雪树+万丙良+殷得所+李进波+夏明元+戚华雄

摘要：以籼粳交品种甬优4949为材料进行花药培养，建立了籼粳交DH群体，并对丰产性较好的DH系进行广亲和基因S5n的PCR检测，获得了含有广亲和基因S5n的DH系材料。

关键词：水稻（Oryza sativa L.）；花药培养；籼粳交；广亲和

中图分类号：S511 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）17-3213-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.17.004

Rapid Breeding of Wide Compatibility Rice Materials by Anther Culture

ZHA Zhong-ping， DU Xue-shu， WAN Bing-liang， YIN De-suo， LI Jin-bo， XIA Ming-yuan， QI Hua-xiong

（Food Crops Institute， Hubei Academy of Agricultural Sciences/Hubei Key Laboratory of Food Crop Germplasm and Genetic Improvement， Wuhan 430064， China）

Abstract： DH population was got by anther culture from Yongyou 4949， which is a indica-japonica hybrid rice. The wide compatibility gene S5n were detected by PCR in the DH lines with high yield potential and the DH lines with wide compatibility gene S5n were obtained.

Key words： rice （Oryza sativa L.）； anther culture； indica-japonica hybrid； wide compatibility

水稻（Oryza sativa L.）是世界上重要的糧食作物之一，在其长期的栽培驯化过程中形成了籼、粳2个亚种[1-5]，亚种间的杂种一代具有强大的杂种优势，水稻籼、粳亚种间杂种优势的利用是进一步提高水稻单产的重要途径之一。但籼、粳亚种间杂种一般结实率偏低、子粒充实度差，这些问题制约了亚种间杂交稻的利用[6]。水稻广亲和基因S5n可克服籼粳生殖障碍，与籼稻或粳稻亚种杂交能产生正常可育的后代[7]。培育和利用广亲和水稻品种是促进水稻籼粳杂种优势、进一步提高水稻产量的当务之急。但已知的广亲和品种多为农艺性状欠佳的农家品种，不能直接作为亲本使用；而常规育种方法选育优良性状的广亲和品种需要杂交、回交、转育，耗时冗长，育种周期长。近年来育种家们育成了甬优12、浙优18、春优84[8-11]等一批综合性状优良的籼粳亚种间组合，为进一步利用籼粳间杂种优势奠定了良好的基础。

水稻花药培养可以快速获得纯系、提高选择效率、有效缩短育种周期。试验以目前生产上优良的籼粳组合甬优4949为材料，利用水稻花药培养方法获得纯合DH（双单倍体）系，并对DH系进行广亲和基因S5n的PCR检测，为快速选育广亲和水稻材料提供了一条有效途径。

1 材料与方法

1.1 材料

甬优4949是由宁波市种子有限公司和武汉佳禾生物科技有限责任公司培育的三系籼粳杂交中稻品种。2015年通过湖北省农作物品种审定委员会审定。本试验所用甬优4949由武汉佳禾生物科技有限责任公司提供。

1.2 方法

1.2.1 水稻材料种植 2015年春季在武汉分期播种，大田移栽，以获得足够发育时期适宜的花药。具体分期播种和移栽时间见表1。

1.2.2 花药取材 2015年7月起，分期播种的甬优4949依次进入孕穗期。于晴天的下午取单核靠边期的幼穗，为保证幼穗新鲜，取样时幼穗留2节及2～3片叶片，放在盛有清水的桶中。取好的幼穗在室内显微镜下观察花粉母细胞发育时期。

1.2.3 预处理 田间取回的幼穗在实验室里重新修剪，保留幼穗2叶1节，75%乙醇表面消毒后，用保鲜膜包好幼穗，放在4 ℃冰箱中预处理7～10 d。

1.2.4 诱导培养 预处理结束后，剥去多余叶片和叶鞘，留取发育适宜的带枝小穗，装入无菌烧杯中，先用75%乙醇表面消毒30 s，再用0.1% HgCl2溶液浸泡10 min左右，无菌水冲洗3～4次，每次1 min，最后用无菌滤纸吸干小穗水分。在超净工作台上用剪颖抖药法将花药接种至诱导愈伤培养基上，诱导培养基为设置不同基本培养基和不同碳源4种培养基，分别为①N6+2，4-D 2 mg/L+KT 1 mg/L+NAA 3 mg/L+蔗糖50 g/L；②N6+2，4-D 2 mg/L+KT 1 mg/L+NAA 3 mg/L+麦芽糖50 g/L；③SK3+2，4-D 2 mg/L+KT 1 mg/L+NAA 3 mg/L+蔗糖50 g/L；④SK3+2，4-D 2 mg/L+KT 1 mg/L+NAA 3 mg/L+麦芽糖50 g/L。每个三角瓶约接种80～100个花药，25 ℃左右暗培养至愈伤组织直径达2 mm左右。

1.2.5 分化培养及生根 将直径2 mm以上的愈伤组织在超净工作台上转移到分化培养基，分化培养基为实验室水稻通用分化培养基（MS+KT 2 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L）。25 ℃、1 000～1 500 lx、10～12 h/d光照培养直至绿苗分化。当绿苗长到5 cm以上时，在超净工作台上将绿苗转移到生根培养基上进行生根。生根培养基为 1/2MS+NAA 0.5 mg/L+活性炭0.8 g/L+蔗糖20 g/L。endprint

1.2.6 纯合DH系的获得 将根系发育良好的再生植株经过炼苗后移植到大田，每个愈伤组织来源的植株单株收种，每个单株获得的种子次年种成株系，通过田间农艺性状调查，选取田间农艺性状纯合株系10～30个。结合室内考种，选取农艺性状优良、结实率高、丰产性好的DH系5～15个。

1.2.7 广亲和水稻材料的获得 对农艺性状优良、丰产性好的优良纯合DH系进行广亲和基因S5n的PCR检测。广亲和基因S5n检测的正向引物（F1）序列为5′-ATCAACCCATTTCCTTTCCT-3′，反向引物（R1）序列為5′-ATACGCTCGATCGGATTAAC-3′，含有广亲和基因S5n的DH系能扩增出441 bp的片段，而不含有广亲和基因S5n的品种扩增出的片段为577 bp。PCR扩增体系为10×含Mg2+的PCR缓冲液1.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.2 μL，Taq DNA聚合酶 1 U，DH系基因组DNA模板1 μL，10 μmol/L的正向引物F1 0.2 μL，10 μmol/L的反向引物R1 0.2 μL，ddH2O补充体积至15 μL。PCR反应条件为94 ℃预变性4 min；94 ℃变性 40 s，50 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环；然后72 ℃延伸5 min。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物带型，紫外凝胶成像系统照像。

2 结果与分析

2.1 甬优4949花药取材的适宜时期

通过显微镜观察发现，甬优4949品种花粉母细胞发育处于单核靠边期的幼穗叶枕距一般在6～10 cm，此时幼穗的颖壳宽度已接近成熟的大小，颖壳呈现淡绿色，雄蕊伸长达颖壳的1/3～1/2。取材时叶枕距随温度的变化略有不同，温度越高，叶枕距越短；温度越低，叶枕距越长。

2.2 甬优4949花药培养再生体系的建立

4种诱导培养基的诱导率分别为15.04%、7.30%、10.77%和4.71%。表明对于甬优4949，N6比SK3基本培养基的诱导率高，蔗糖比麦芽糖的诱导率高。利用实验室水稻通用分化培养基，甬优4949共获得绿苗2 424株，平均绿苗分化率为13.95%。

2.3 纯合DH系的获得

2015年冬季将根系发育良好的再生植株经过炼苗后带到海南大田移植，每个愈伤组织来源的植株单株收种。每个单株获得的种子2016年种成株系，通过田间农艺性状调查，选取田间农艺性状纯合株系22个。结合室内考种，选取农艺性状优良、结实率高、丰产性好的DH系12个，DH系编号及室内考种结果见表2。

2.4 广亲和水稻材料的获得

对上述12个农艺性状优良、丰产性好的优良纯合DH系进行广亲和基因S5n的PCR检测，检测结果见图1。由图1可知，2016DH283、2016DH420、2016DH504、2016DH760、2016DH913共5个DH系能扩增出441 bp的目标片段，说明这5个株系均含有广亲和基因S5n。

3 讨论

广亲和基因S5n是能够恢复籼粳杂交杂种育性的基因，利用常规育种获得亲和基因耗时冗长。在水稻细胞工程育种中，水稻花药培养作为一项高效、实用、成熟的育种新技术具有能有效缩短育种周期、扩大变异范围、提高选择效率、加速有效性状转移等优势，在水稻新品种选育、三系提纯改良、种质资源创新、籼粳远缘杂种优势利用、三系与两系杂交稻选育及水稻基因工程育种等方面应用越来越广泛。同时，通过花药培养建立的DH群体属于永久的遗传资源，有着广泛的用途，水稻中己有不少DH群体，但很少有籼粳交DH群体的建立。而籼粳间杂种优势强，有效利用其杂种优势已成为培育超级稻的主要方向[12]。本研究中，利用目前生产上推广应用的籼粳交品种甬优4949为材料，不仅建立了对籼粳杂交育种和研究具有较大应用潜力的DH群体，而且通过分子标记技术选育了含有广亲和基因的纯合DH系。本研究不仅大大缩短了选育广亲和水稻材料的育种年限，更为促进籼粳交杂种优势利用提供了丰富的育种资源。

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