盐碱土壤转Bt基因棉花外源蛋白表达量时空变化及对抗虫性的影响

雒珺瑜,崔金杰,张 帅,朱香镇,吕丽敏,王春义,张利娟,王 丽,李春花,周治国

1 中国农业科学院棉花研究所,棉花生物学国家重点实验室,安阳 455000 2 南京农业大学农学院,农业部南方作物生理生态重点开放实验室,南京 210095

盐碱土壤转Bt基因棉花外源蛋白表达量时空变化及对抗虫性的影响

雒珺瑜1,崔金杰1,张 帅1,朱香镇1,吕丽敏1,王春义1,张利娟1,王 丽1,李春花1,周治国2,*

1 中国农业科学院棉花研究所,棉花生物学国家重点实验室,安阳 455000 2 南京农业大学农学院,农业部南方作物生理生态重点开放实验室,南京 210095

盐碱地是潜在的可利用耕地资源,但土壤盐碱化严重制约了农业生产的可持续发展。基于棉花机械化程度低、劳动力成本和生产资料投入剧增、比较效益下降和实施粮食生产安全战略等因素影响,我国长江流域和黄河流域棉花面积锐减,种植区域向内陆盐碱旱地或滨海盐碱地转移,但目前针对盐碱地转Bt基因棉种植可能带来的生态安全性问题研究甚少,正成为国内外研究的焦点和热点。伴随着棉花向盐碱地大面积转移种植趋势,检测盐胁迫是否影响转基因抗虫棉抗虫性,明确其影响程度,直接关系到转基因抗虫棉种植的安全性,也是目前抗虫棉扩大生产中迫切需要解决的问题。以非转基因棉花为对照,分别在低盐、中盐和高盐土壤种植的棉花的苗期、蕾期和花铃期采样,室内测定了转Bt基因棉花叶片对棉铃虫幼虫校正死亡率和外源蛋白表达量。研究结果发现盐分胁迫下转Bt基因棉花苗期叶片对棉铃虫幼虫校正死亡率下降了9.22%—47.46%,蕾期下降了31.61%—45.42%,花铃期下降了3.59%—18.52%；土壤盐分显著降低了转Bt基因棉花叶片中外源蛋白的表达量,苗期功能叶外源蛋白表达量下降了7.66%—29.86%；蕾期下降了3.77%—36.85%；花铃期下降了18.13%—41.02%；相关性分析表明,盐分胁迫条件下转Bt基因棉花叶片中外源蛋白表达量与其对棉铃虫抗性程度存在正相关关系。结果表明,盐碱土壤显著降低了转Bt基因棉花叶片外源杀虫蛋白表达量,从而导致转Bt基因棉花叶片对棉铃虫的抗虫性下降。研究土壤盐分对转Bt基因棉花对棉铃虫的影响及其作用机制,可为建立盐碱地转Bt基因棉花田害虫综合防控技术体系、转Bt基因棉花环境安全评价及转Bt基因棉安全管理提供依据。

土壤盐分；转Bt基因棉花；外源蛋白表达量；抗虫性；时空变化

Abstract： Saline-alkali land is a potentially exploitable reserve cultivated land resource, but it severely restricted the sustainable development of agricultural production. Owing to some factors such as the decreasing degree of cotton mechanization, increasing input of labor cost and production goods, declining comparative benefits, and implementing the strategy of food security, the cotton area in the Yangtze River and Yellow River is declining sharply, and the planting area is transferred to Binhai saline-alkali lands. Since the study of ecological security of planting Bt cotton in saline-alkali land is rare, it became the focus of many research studies worldwide. Whether the resistance of transgenic Bt cotton to cotton bollworm has been affected remains to be elucidated. Resistance is directly related to the environment safety of transgenic Bt cotton; therefore, there is an urgent need to solve the problems in cotton production. With the non-transgenic cotton as the control, we measured the corrected mortality of transgenic Bt cotton to cotton bollworm larvae and the contents of exogenous protein of transgenic Bt cotton that was planted in the low-, medium- and high-salt soil at seedling, budding, and flowering and bolling stages, respectively. The results showed that at the seedling, budding, and flowering and bolling stages of transgenic Bt cotton in low salt stress, the correction mortality of transgenic Bt cotton planted in the medium- and high-salt soil to cotton bollworm larvae decreased by 9.22%—47.46%, 31.61%—45.42%, and 3.59%—18.52%, respectively. Over the same period of Bt cotton, soil salinity significantly inhibited the expression of Bt protein in cotton leaves and decreased by 7.66%—29.86%, 3.77%—36.85%, and 18.13%—41.02% at seedling, budding, and flowering and bolling stages, respectively. There is a significant positive correlation between the efficiency of insect resistance of transgenic Bt cotton to cotton bollworm larvae and Bt protein content. Therefore, soil salinity levels inhibited the exogenous protein expression of transgenic Bt cotton, which led to the decreased resistance of transgenic Bt cotton on cotton bollworm. The present study on the effects and mechanisms of soil salinity on the influence of transgenic Bt cotton to cotton bollworm can provide a comprehensive basis for establishing Bt cotton pest prevention and control technology system, environmental safety evaluation, and safety management in soil salinity in Bt cotton fields.

KeyWords: soil salinity; transgenic Bt cotton; expression of the exogenous protein; insect resistance; temporal and spatial variation

气候条件的日益恶化,土壤盐渍化已成为制约世界农业可持续发展的重要因素[1- 2]。我国是盐碱地面积最大的国家之一,棉花是我国重要的经济作物,也是一种中等耐盐碱作物,为保障我国粮食生产和棉花生产安全,潜在可利用的大面积盐碱地是棉花生产的主要方向[3]。

盐分对植株地上部形态、生理特征、光合作用、代谢进程等方面的影响的研究已引起很多专家和学者的关注与研究[4- 6]。我国转Bt基因棉花的种植面积超过370万hm2,占我国棉花种植面积的96%以上[7],转Bt基因棉花不仅有效对抗棉花棉铃虫,也因为减少农药的使用也对人类与环境友好[8],同时随着转基因抗虫棉的推广普及,棉田害虫生态地位发生了重大变化,棉田次要害虫上升为主要害虫[9- 12],并呈现逐步蔓延和大面积灾变的发展趋势[13-18]；同时,环境条件对转Bt基因棉花抗虫效果有重要的影响[8],其中温度[19-21]、干旱、涝渍[22-24]等逆境条件均能抑制棉花的抗虫性和外源蛋白的表达量,而施氮量可促进转Bt基因棉花外源蛋白的合成,促使棉花抗虫性增强[25-26]。盐胁迫转Bt基因棉花对棉铃虫控制作用及其外源蛋白表达量变化方面的研究,Iqbal等[27]在对印度多种棉花进行了盐胁迫和外源蛋白的检测,表明胁迫盐分浓度与外源蛋白含量成反比。Jiang等[28]在室内采用NaCl胁迫棉花结果表明,盐分胁迫抑制了转Bt基因棉花苗期叶片外源蛋白表达量。前人在室内且单一NaCl胁迫下在棉花苗期进行了实验,对棉花生长后期外源蛋白表达量变化规律未见明确报道,对转Bt基因棉花受盐分胁迫响应的认识仍然有限,且棉田害虫主要发生在棉花生长的中期和后期,土壤盐分胁迫对棉花整个生长发育时期外源蛋白表达量时空变化直接影响转Bt基因棉花对棉铃虫抗性的变化是目前生产上重要的需要解决的问题。

因此,在粮棉争地矛盾日益突出,盐渍化和次生盐渍化土壤不断加剧的背景下,基于转Bt基因棉花向盐碱地大面积转移种植趋势,明确盐碱土壤种植转Bt基因棉花其外源蛋白表达量时空变化规律及其与抗虫性的关系,采取耐盐碱栽培调控措施,增强棉花自身对外界逆境的抵御能力,提高棉花产量和品质是确保盐碱地棉花丰产丰收的迫切需要和关键因素之一。本文以转Bt基因棉花为试验材料,以其亲本非转基因棉花为对照,在盐碱地原位土柱中进行了连续2a的重复研究试验,从土壤盐分水平动态、转Bt基因棉花叶片外源蛋白表达量时空变化入手,研究并阐明盐碱土壤转Bt基因棉花外源蛋白表达量时空变化对抗虫性的影响,为棉花生产中增强盐碱地转Bt基因棉花对害虫及外界逆境胁迫的抵御能力采取栽培调控技术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

棉花材料 GK19为转Cry1Ac基因棉花,启动子为35s,终止子为NOS,由湖北省沙洋监狱管理局农业科学研究所、湖北省种子管理站、中国农业科学院生物技术研究所等单位选育,2002年通过山西省审定；泗棉3号为GK19的亲本受体,为非转基因棉花,均由湖北省农业科学院植保土肥所提供。

棉花种植 试验于 2013年和2014年的 6月至9 月开展。棉花种植于江苏大丰市稻麦原种场试验农场。选择田间盐分水平差异较大的3个地块作为低盐、中盐和高盐胁迫处理,在各盐分土壤原位设置土柱,棉花采用营养钵育苗移栽方法种植,棉花管理按高产栽培要求进行。

1.2 测定内容与方法

1.2.1 土壤盐分测定

在棉花苗期、蕾期和花铃期,用土壤取样器采集棉株根际周围0—2 cm范围内距地表10—20 cm土层土壤室内自然风干后,研磨去杂过筛,采用“质量”法进行盐分含量测定[29]。

称取风干土样100.0 g放入1000 mL广口三角瓶中,加入去CO2水500 mL后塞紧瓶口,放入摇床120 rpm/min振荡20 min,3000 rpm/min离心5 min至上清液透明；吸取上清液100 mL,移入已知重量的250 mL三角瓶中,放置在水浴上蒸干后放入烘箱105℃烘干4 h,取出移入干燥器中冷却约30 min在分析天平上称重；再放入烘箱105℃重复烘2 h,冷却,称至恒重,要求两次重量之差不得大于0.0003 g。可溶性盐分计算公式如下：

可溶性盐含量(%)=(m1-m0)/m× 100

式中,可溶性盐总量为土壤可溶性盐总量质量分数(%)；m1为烧杯与盐分质量之和(g)；m0为空烧杯质量(g)；m为吸取待测液体积相当样品质量(g)；100为换算成每百克含量。

1.2.2 转Bt基因棉抗虫性生物测定

(1)试虫来源 棉铃虫由中国农业科学院棉花研究所养虫室提供,系2012年9月采自田间,在室内(温度:(27±0.5)℃,相对湿度: (75 ± 5%),光照周期；L∶D=14 h∶10 h)连续饲养10代,对化学农药及转Bt基因棉花或Bt制剂没有抗性。

(2)棉铃虫抗性生物测定 参照农业行业标准《棉花抗棉铃虫性鉴定方法》(NY/T2162—2012)[30]和国家标准《转基因植物及其产品环境安全检测抗虫棉花第1部分：对靶标害虫的抗虫性》(农业部1943号公告- 3—2013)[31],在棉花生长的苗期(二代棉铃虫发生期)分别采集棉花主茎功能叶,蕾期(三代棉铃虫发生期)和花铃期(四代棉铃虫发生期)分别采集棉花上部果枝顶部嫩蕾对位叶进行室内抗虫性生物测定。每小区采集10片棉花叶片,每片叶片装进一个生物测定盒(高10 cm,直径8 cm),人工接入1 d龄棉铃虫幼虫,盖紧盒盖,置于温度为(27±0.5)℃,相对湿度(75%±5%),光照周期L∶D=14 h∶10 h条件下饲养5 d,第6天调查生测盒内棉铃虫存活数；以非转基因棉花泗棉3号叶片的棉铃虫幼虫死亡率为对照,计算转基因抗虫棉GK19棉花对棉铃虫幼虫抗性的校正死亡率。计算公式如下：

式中,处理材料幼虫死亡率为转基因抗虫棉花幼虫死亡率；对照材料幼虫死亡率为非转基因棉花幼虫死亡率；1为校正常数。

1.2.3 外源Bt蛋白检测

取样 在棉花生长的苗期(二代棉铃虫发生期)分别采集棉花主茎功能叶,蕾期(三代棉铃虫发生期)和花铃期(四代棉铃虫发生期)分别采集棉花上部果枝顶部嫩蕾对位叶。每小区采集5片叶片,-80℃速冻后保存,用于Bt蛋白表达量的测定；采样时间和部位与生物测定取样一致。

Bt蛋白检测 采用ELISA方法,称取新鲜棉花叶片0.4 g,液氮快速研磨,加入4 mL PBS提取液,4℃摇床(200 r/min)过夜；8000 r/min离心取上清待测；外源蛋白表达量检测操作均按检测试剂盒说明书严格进行,检测试剂盒为美国ENVIROLOGIX公司生产的Cry1Ac/Cry1Ab(型号AP003 CRBS)检测试剂盒。

1.3 数据统计与分析方法

利用 Excel 软件对数据进行基本处理和筛选,针对研究区土样和测定分析结果,运用 SPSS 17.0 软件对所有数据进行统计分析,采用单因素方差分析(One-way analysis,ANO-VA) 和 Duncan′s 差异显著性分析(P<0.05),检验同一时期不同小区转Bt基因棉花室内生物测定及外源Bt蛋白含量显著性差异；同时利用该软件采用比较平均值方法进行了相关性分析。

2 结果

2.1 棉田土壤盐分水平动态变化

土壤盐分水平见表1。棉田土壤盐分水平随棉花生长发育时期和季节变化呈现出动态变化趋势。2013年土壤盐分水平分别在苗期、蕾期和花铃期表现出逐渐升高的趋势,2014年在苗期和蕾期表现升高,花铃期下降；盐分处理间差异显著(2014年苗期除外)。

表1 土壤盐分水平动态变化规律/%

SL：泗棉3号低盐处理Treatment of low soil-salinity to Simian- 3；SM：泗棉3号中盐处理Treatment of medium soil-salinity to Simian- 3；SH：泗棉3号高盐处理Treatment of high soil-salinity to Simian- 3；GL：GK19低盐处理Treatment of low soil-salinity to GK 19；GM：GK19中盐处理Treatment of medium soil-salinity to GK 19；GH：GK19高盐处理Treatment of high soil-salinity to GK 19；小写字母表示同列中相同棉花品种在0.05水平差异显著(P< 0.05)

2.2 土壤盐分对转Bt基因棉花抗棉铃虫幼虫校正死亡率的影响

土壤盐分对转Bt基因棉花抗棉铃虫幼虫校正死亡率的影响如表2。随土柱土壤盐分水平的升高,采自田间土柱中生长的棉花苗期功能叶、蕾期和花铃期蕾对位叶对棉铃虫幼虫校正死亡率呈逐渐下降趋势,下降程度随着盐分水平的增加而增加,其中苗期和蕾期叶片抗性变化差异较大,花铃期未达显著差异。

与低盐田相比,2013年中盐田和高盐田GK 19棉花苗期功能叶对棉铃虫幼虫校正死亡率分别下降了28.05%和47.46%,蕾期分别下降了41.50%和45.42%,花铃期分别下降了3.59%和18.52%。2014年中盐田和高盐田GK 19棉花功能叶对棉铃虫幼虫校正死亡率分别下降了9.22%和23.08%,蕾期分别下降了31.61%和41.07%；花铃期分别下降了15.81%和17.23%。表明随土壤盐分水平升高,转Bt基因棉花叶片对棉铃虫幼虫校正死亡率下降,下降幅度在不同时期和不同盐分处理间有所不同。

表2 不同土壤盐分水平下转Bt基因棉花叶片对棉铃虫幼虫抗性死亡率的影响/%

小写字母表示同列在0.05水平差异显著(P< 0.05)

2.3 土壤盐分对转Bt基因棉花外源蛋白表达量的影响

随着棉花的生长发育进程和土壤盐分水平的升高,采自田间土柱中生长的转Bt基因棉花叶片中外源蛋白表达量均成逐渐下降趋势。与低盐水平相比(表3),2013年中盐和高盐胁迫GK19棉花苗期功能叶外源Bt蛋白表达量分别降低了7.66%和23.71%；蕾期分别下降了26.86%和36.85%；花铃期分别下降了22.52%和41.02%。2014年中盐和高盐胁迫GK19棉花苗期功能叶外源Bt蛋白表达量分别降低11.52%和29.86%；蕾期分别下降了3.77%和31.81%；花铃期分别下降了18.13%和38.32%。表明土壤盐分可显著降低转Bt基因棉花外源蛋白表达量，但抑制程度与盐分胁迫程度和胁迫时间有关。

表3 不同盐分土壤水平对转转Bt基因棉花外源杀虫蛋白表达量的影响/(ng/g)

小写字母表示在0.05水平差异显著

2.4 盐碱土壤转Bt基因抗虫棉对棉铃虫校正死亡率与外源Bt蛋白表达量的相关关系

随土壤盐分水平变化转Bt基因棉花对棉铃虫的抗虫性与外源Bt蛋白表达量呈显著的正相关关系(表4),表明在一定土壤盐分胁迫条件下,转Bt基因棉花抗虫性的下降,主要可能是由于其外源Bt蛋白表达量降低的原因所形成。

表4 不同土壤盐分转Bt基因棉花抗虫性与外源Bt蛋白表达量的相关性

*和**代表在0.05和0.01水平差异显著

3 讨论

3.1 盐碱土壤对转Bt基因棉花抗虫性的影响

棉花叶片是棉铃虫取食的重要器官。转Bt基因棉花对棉铃虫幼虫校正死亡率越高,其对棉铃虫抗虫性越高,反之则抗虫性越低。

高温、干旱和涝渍、氮素等环境条件均能影响转Bt基因棉花外源蛋白的表达,进而影响其抗虫性变化。但盐碱胁迫转Bt基因棉花对其抗虫效果和外源蛋白表达量的研究方面也有学者在室内通过单一NaCl胁迫棉花苗期进行研究。本文是在盐碱地自然条件下设置原位土柱中进行的胁迫试验,明确了盐碱土壤转Bt基因棉花叶片对棉铃虫的抗虫性具有时空动态性,盐分胁迫下转Bt基因棉花叶片对棉铃虫抗虫性下降,而Jiang 等[28]在室内研究结果显示NaCl胁迫转基因棉花苗期叶片对棉铃虫的抗性未达到显著差异水平,本文测得的转基因棉花叶片对棉铃虫的抗性程度下降,可能是由于前人是在室内幼苗期单一盐分条件下进行的试验,本文是在田间自然状态下进行的试验,田间盐分表现形式不同,盐离子种类也比较复杂,引起转基因棉花抗虫性的变化有差异；同时采样时期都是在苗期,但本文是在5—7叶期进行采样测定,可能与前人采样时期有差异而形成；另外前人与本试验所使用的转基因棉花品种不同,棉花品种本身蛋白含量表达量高，盐分胁迫后外源蛋白含量的下降量不足以引起抗虫性的下降，可能也是出现影响差异的原因。

3.2 盐碱土壤对转Bt基因棉花外源蛋白表达量的影响

转Bt基因棉花抗虫的物质基础是外源蛋白的表达[32- 33],Bt蛋白的表达受棉株生长发育及环境变化的调控[34],且对调控因素具有高度的依赖性[35- 37]。本文系统测定了采自盐碱地原位土柱种植的转Bt基因棉花叶片中外源蛋白表达量,表明盐碱地转Bt基因棉花外源蛋白表达量呈时空动态性,揭示了土壤盐分含量显著抑制了转Bt基因棉花外源蛋白的表达,与Iqbal等[27]、李茂营[38]在室内或盐池内采用NaCl胁迫棉花生长测定Bt蛋白质含量变化趋势一致。同时本文对土壤盐分胁迫下转基因抗虫棉花叶片中外源蛋白表达量和抗虫性两者相关关系进行分析,明确了盐碱土壤转Bt基因棉花叶片对棉铃虫抗虫性下降的物质机制主要是由于转Bt基因棉花受到盐分胁迫后其外源蛋白表达量下降而造成的，但不同盐分胁迫程度和胁迫时间，对棉花外源蛋白表达量和抗虫性影响不同。但年度间差异主要原因可能是因为取样时降雨或棉田灌溉引起盐分下移,上层土壤中盐分含量降低,在后续研究中应结合土壤肥力、土壤理化性质和气象因子(尤其是淋雨)进行系统分析；同时可能由于棉花根系较大,只测定10—20cm土层的土壤盐分对棉花的胁迫作用尚不够完善,需进行不同深度土壤层盐分的胁迫成都进行深入分析。

本文试验是在自然田间盐碱地进行的原位土柱试验,土柱土壤盐分与大田土壤盐分基本一致。随着棉花生育时期和季节变化规律,盐分也在不断变化,且是在整个棉花生长发育最关键的时期苗期、蕾期和花铃期进行的系统研究,此期正是棉田害虫发生的重要时期。因此该盐分胁迫试验更有利于了解盐碱地转Bt基因棉花的抗虫性和外源蛋白表达量在整个棉花生长季随土壤盐分水平变化的变化规律,可跟随变化的实际情况,采用栽培措施改变盐分对转基因抗虫棉的胁迫,同时需适时监测棉田棉铃虫发生种群动态,并根据监测动态进行适时防治。

4 结论

随着棉花生育进程,转Bt基因棉花对棉铃虫抗性校正死亡率和外源Bt蛋白含量呈下降趋势。盐碱土壤种植转Bt基因棉花对其抗棉铃虫校正死亡率和外源Bt蛋白表达量有显著抑制作用。本实验条件下土壤盐分水平升高,其降低幅度越明显。相关性分析表明,土壤盐分降低了转Bt基因棉外源杀虫蛋白表达量,致使转Bt基因棉花对棉铃虫抗性下降。说明盐碱土壤种植转Bt基因抗虫棉,外源杀虫蛋白表达量受到抑制,不利于抗虫棉对棉铃虫的抗性优势的发挥；同时由于室内离体测定结果与田间自然条件下棉花生长状态及棉田气候等造成田间棉铃虫种群动态的发生危害情况还有一定的差距,相关田间的研究报道较少,还需要监测棉田害虫发生动态,根据害虫实际消长动态情况适时进行化学防治。

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TheeffectsoftemporalandspatialvariationofexogenousproteinoftransgenicBtcottontoinsectresistanceinsaline-alkalisoil

LUO Junyu1, CUI Jinjie1, ZHANG Shuai1, ZHU Xiangzhen1, LU Limin1, WANG Chunyi1, ZHANG Lijuan1, WANG Li1, LI Chunhua1, ZHOU Zhiguo2,*

1InstituteofCottonResearchofChineseAcademyofAgriculturalSciences/StateKeyLaboratoryofCottonBiology,Anyang455000,China2CollegeofAgriculture,NanjingAgriculturalUniversity/KeyLaboratoryofCropPhysiology&EcologyinSouthernChina,MinistryofAgriculture,Nanjing210095,China

国家自然科学基金(31501253)

2016- 05- 30; < class="emphasis_bold">网络出版日期

日期:2017- 03- 27

*通讯作者Corresponding author.E-mail: giscott@ njau.edu.cn

10.5846/stxb201605301036

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