邻苯二甲酸酯类雌激素活性联合作用模型分析

何颖，张晖,*，甄士琪，张丽娟，曹驰程，章奇

1. 东南大学公共卫生学院 环境医学工程教育部重点实验室，南京 2100092. 江苏省疾病预防控制中心食品安全与评价所，南京 210009

邻苯二甲酸酯类雌激素活性联合作用模型分析

何颖1，张晖1,*，甄士琪2，张丽娟1，曹驰程1，章奇1

1. 东南大学公共卫生学院 环境医学工程教育部重点实验室，南京 2100092. 江苏省疾病预防控制中心食品安全与评价所，南京 210009

环境雌激素对生命健康影响受到广泛关注，现行污染物环境标准制订和风险评价只针对单一化合物而非混合物效应，不足以保护生命安全与人类健康。为探讨环境雌激素的混合物效应，选择对雌激素敏感的人乳腺癌MCF-7细胞增殖实验，检测雌二醇(E2)、邻苯二甲酸酯类化合物(DBP和DEHP)的单一及其联合雌激素活性；基于单一化合物的浓度-反应曲线，运用浓度相加(CA)和独立作用(IA)模型对混合物的毒性进行预测，并将模型预测结果与混合物实验数据进行比较分析。结果表明，E2、DBP、DEHP对MCF-7细胞的单一作用数据可通过Weibull方程拟合，由拟合方程得到的半数效应浓度(EC50)及95%置信区间分别为3.450×10-6(2.373×10-6～1.675×10-5)、5.138(1.489～1.082×10)、1.186(4.478×10-1～2.24) μmol·L-1；3种化合物的混合物数据亦可通过Weibull、Logistic和ExpGro1方程进行有效拟合，混合物效应与化合物单独作用产生的效应具有显著性差异；3种化合物表现非相似联合作用，利用独立作用(IA)模型预测混合物效应较为可靠，外源性环境雌激素与内源性雌激素联合作用产生的混合效应显著。环境雌激素混合物毒性可以通过相加作用模型预测，为环境复合污染的风险评价和管理提供基础数据。

邻苯二甲酸酯类；MCF-7细胞；雌激素活性；联合作用

Received22 April 2017accepted31 May 2017

Abstract: Estrogens in the environment have received extensive concerns due to their potential risks to human health. The present environmental standards and risk assessment procedures have limitation in the protection of human health and safety, because they are on the basis of the single effects of chemical compounds, rather than the combined effects. To investigate the combined effects of estrogens, the single and joint toxicities of three estrogens, including estradiol (E2) and phthalic acid ester compounds (DBP and DEHP), were investigated using the estrogen-sensitive MCF-7 human breast cancer cells proliferation assay. The individual concentration-response curves of the three estrogens were applied to predict the joint toxicity of their mixtures according to the concentration addition (CA) and the independent action (IA) models. The predicted concentration-response curves were further compared with the experimental data. The results showed that the single effects of E2, DBP, and DEHP were well fitted by Weibull equation, and their EC50(95% confidence interval) values were 3.450×10-6(2.373×10-6-1.675×10-5) μmol·L-1, 5.138 (1.489-10.820) μmol·L-1, and 1.186 (0.448-2.240) μmol·L-1, respectively. The effect from the mixtures of the three estrogens were well described by Weibull, Logistic, and ExpGro1 equations, while significant differences were observed between the single effects of the three estrogens and the combined effects of their mixtures. The three compounds showed dissimilar joint actions, and the IA model was more appropriate to predict the combined effects compared to the CA model. The combined effects of exogenous environmental estrogen and endogenous estrogen were significant. Overall, the toxicity of estrogens mixtures can be predicted by the additive model, providing the basic data for the risk assessment and management of combined pollution in the environment.

Keywords: phthalates; MCF-7 cells; estrogenic activity; combination effects

邻苯二甲酸酯类(phthalic acid esters, PAEs)化合物是一种增塑剂，主要包括：邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(diethylhexyl phthalate, DEHP)、邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate, DBP)、邻苯二甲酸二异壬酯(diisononyl phthalate, DINP)等，被广泛应用于塑料容器、食品包装和个人护理用品等数百种产品中[1-2]。研究报道，增塑剂为环境内分泌干扰物，与生殖障碍、出生缺陷、发育异常和代谢紊乱有关[3]。现实生活中，机体总是同时或相继暴露于多种环境污染物，特别是环境雌激素的浓度-反应关系非线性，往往呈现低剂量效应，彼此间表现各种联合作用[4]。现行只对单一化合物而非混合物效应进行的评价，可能不足以保护生物安全和人类健康，需要研究混合物效应评价和预测方法[5-7]。

化合物相互作用分为无交互作用和有交互作用2种情况，无交互作用就是我们通常定义的“相加作用”类型，相加作用是联合作用定量分析的前提和基础，有Loewe相似作用和Bliss独立作用[8-10]，前者表示联用化合物作用机理相似，有对数剂量-概率单位平行，联用效应相当于同一物质的几个不同剂量合用，即浓度相加(concentration addition, CA)；而后者指联用化合物作用机理不同，即独立作用或反应相加(independent action or response addition, IA)。在药理学和数理统计学基础上可推导出二类数学模型：浓度相加模型(concentration addition, CA)和反应相加模型(independent action or response addition, IA)。浓度相加适用于相似联合作用，从“毒性单位”的概念出发；反应相加模型适用于独立联合作用，根据概率论中“独立事件的概率相加公式”推导而来，适合于作用机理不同的几种化合物的相加计算。实际情况下我们往往不能够准确判断相加作用的类型，所以，在评价时，需要同时应用2类模型综合分析评价。如果混合物实际测得的效应与模型预测结果相一致，则分别为模型所定义的相加作用类型。

本文通过雌激素依赖型人乳腺癌MCF-7细胞体外增殖实验(E-screen assay)，对PAEs的联合作用进行研究，先建立单个化合物雌激素活性效应数据库，在对单个化合物浓度-反应关系进行非线性回归分析的基础上，应用2类相加作用数学模型，预测PAEs混合物的生物效应，并与实际测得的混合物效应结果比较，进而有助于判断该类化合物联合作用类型，同时测试了模型的预测效力和实用性，为化合物联合作用的预测提供理论依据和实用方法。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验材料

1.1.1 测试化合物

3个受试化合物为：17β-雌二醇(17β-estradiol，E2，CAS:50-28-2)，纯度≥98%，分子式C18H24O2，分子量272.38，购自美国Sigma公司；邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(diethylhexyl phthalate，DEHP，CAS:117-81-7)分子式C24H38O4，分子量390.56，标准品，购于美国AccuStandard公司；邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate，DBP，CAS:84-72-2)，分子式C16H22O4，分子量278.34，标准品，购于美国AccuStandard公司。

1.1.2 试剂与仪器

用于细胞培养的DMEM高糖培养基、无酚红DMEM培养基、胰酶和胎牛血清(FBS)购自美国Hyclone公司；噻唑蓝(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司。

仪器包括超净工作台(BSG-1500ⅡA2-X，济南鑫贝西生物技术有限公司)、CO2培养箱(Series 8000WJ, Thermo Scientific, USA)，倒置显微镜(IX2-ILL30, Olympus, Japan)，酶联免疫检测仪(Epoch, BioTek instruments, Tnc., USA)等。

1.2 MCF-7细胞增殖实验(E-screen assay)

经雌激素受体ERα基因表达实验证实本实验选用的MCF-7细胞为ERα阳性的雌激素依赖型细胞，这也进一步验证了细胞增殖实验结果的敏感性和可靠性。

采用MTT作为显色底物进行细胞增殖实验[11]，MTT全称3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，化学名为3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐，又称噻唑蓝，是一种接受氢离子的黄色染料。具体实验步骤如下：MCF-7细胞复苏后用10% FBS高糖DMEM培养基，于5% CO2、37 ℃条件下正常培养至3代以上。实验前48 h将原培养基替换为含5% CDT-FBS的无酚红高糖DMEM培养液。收集细胞，调整细胞悬液浓度，以每孔200 μL约6 000～7 000个细胞接种于96孔板中。继续培养至细胞贴壁后吸去旧培养液，加入200 μL无酚红培养基配制的不同浓度梯度的化合物或混合物，每个浓度均设置5个复孔。培养48 h后，弃去原有培养基，加入5 mg·mL-1MTT和无血清无酚红DMEM培养基混合液200 μL，继续培养3～4 h。1 mL注射器吸去孔内的培养液，每孔加入150 μL DMSO，充分溶解紫色结晶物。选择490 nm波长，用酶联免疫检测仪测定各孔的光密度(OD)值。

以体积分数为0.1%的DMSO为溶剂对照，浓度为1 nmol·L-1的E2作为阳性对照，结果用校正相对增殖效应(relativistic proliferation effect, RPE)表示，RPE=(实验组OD值-溶剂对照组OD值)/(阳性对照组OD值-溶剂对照组OD值)×100%。

1.3 混合物效应预测模型

根据单一化合物的数据拟合浓度-反应曲线，运用浓度相加(CA)和独立作用(IA)模型对混合物的联合毒性进行预测[12-13]。

浓度相加(CA)模型用下式表示：

式中：pi为混合物中化合物i的浓度占总浓度的分数；ECxmix(单位：μmol·L-1)为引起x效应的混合物预测总浓度；其中ECxi(单位：μmol·L-1)可通过单个化合物剂量-反应回归方程的反函数求得，即：

独立作用(IA)模型如下：

式中：Eci为混合物中各化学物在ci浓度时所产生的效应，可通过剂量-反应关系方程或内插法计算得到，即：

式中：Fi为单个化学物i的剂量-效应函数，对于给定混合物效应x可通过迭代算法计算。

1.4 数据统计学分析

采用SPSS19.0软件和Excel软件对实验结果进行统计学分析和计算[14-15]。浓度-反应关系采用origin7.5软件进行非线性曲线拟合，选择拟合相关决定系数R2值最大的方程为最优拟合方程，同时绘制浓度与细胞相对增殖效应的关系曲线。

2 结果与分析(Results and analysis)

2.1 化合物对MCF-7细胞增殖效应影响的实验结果

(1)单个化合物

在预试验基础上确定了3个化合物作用浓度范围，实验结果经计算得出各化合物对MCF-7细胞的相对增殖效应(RPE)，表明3个化合物均能促进MCF-7细胞增殖，在设定浓度范围内呈正相关关系。由图1可知，17β-雌二醇(17β-estradiol, E2)浓度在0.01 pmol·L-1～1 nmol·L-1范围内，细胞相对增殖效应逐渐增大；浓度在1 nmol·L-1时达最大，表明E2在此浓度下雌激素活性最强。邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(diethylhexyl phthalate, DEHP)、邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate, DBP)的浓度-反应关系亦是正相关关系，随着浓度的增加，增殖效应逐渐增大，DBP在100 μmol·L-1，DEHP在10 μmol·L-1，细胞增殖效应最大。

运用非线性回归方法对实验测得的浓度-反应数据进行非线性曲线拟合，并将多个函数拟合的曲线进行比较，获取拟合度最优的浓度-反应方程，见表1。对比多次拟合结果后发现，E2、DEHP、DBP均是Weibull函数拟合效果最优，说明Weibull函数能够有效表述这3种化合物对MCF-7细胞增殖影响的浓度-反应关系。根据曲线方程及其反函数方程，计算得出各个化合物单一作用于MCF-7细胞的效应浓度(EC50)值。具体的拟合结果(各化合物拟合方程及其参数、决定系数R2值，以及EC50及其95%置信区间(95%CI)见表2，拟合的曲线如图1，将3种化合物的浓度-反应曲线整合在同一坐标系中，可清楚地展示各化合物作用的浓度范围。结合表2和图1中各曲线的位置分布可知，E2的浓度-反应曲线位于最左侧，相对增殖效应最大，EC50为3.450 pmol·L-1；DEHP(EC50=1.186 μmol·L-1)和DBP(EC50=5.138 μmol·L-1)的促增殖能力比E2低105-106倍。这3种化合物对MCF-7细胞的增殖效应为E2 >DEHP>DBP。

(2)混合物

E2、DEHP和DBP等效应固定浓度比混合，即初始混合物按照每种化合物的等效应浓度(如EC50)比例进行混合。构成3种二元混合物E2/DEHP、E2/DBP、DEHP/DBP和1个三元混合物E2/DEHP/DBP，将4个混合物当作4个新的化合物进行实验。将初始混合物依次稀释成初始浓度的100%、50%、10%、5%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%倍，混合物中每种化合物所占的组成比例始终保持一致。

将混合物对MCF-7细胞增殖影响的实验结果进行非线性回归分析，浓度-反应关系拟合模型、参数及对应的R2值见表2，拟合曲线如图2。四参数的Logistic模型对DEHP/DBP的浓度-反应曲线拟合效果最好，决定系数R2=0.995；E2/DEHP和E2/DBP拟合度最优的模型分别为三参数的ExpGro1方程，R2分别为0.977和0.949；E2/DEHP/DBP拟合度最优的模型为二参数Weibull方程，R2为0.996，方程参数及EC50值见表2。从图2中各条曲线的分布不难看出，等效应固定浓度比二元混合物的拟合曲线和95%置信区间均介于单个化合物之间，混合物的EC50也都介于单个化合物之间；混合物实验数据拟合曲线形状不同于单独作用的拟合曲线，化合物单独作用的效应和产生的混合物效应显著不同；外源化合物单独作用下在较低浓度时产生的效应较弱，但联合作用下会产生显著的混合物效应。

图1 单一化合物浓度-反应曲线Fig. 1 Concentration-response fitting curves for each of the individual chemical

表1 拟合度最优模型方程及其反函数方程Table 1 The best-fit regression models and its inverse function

图2 各种混合物联合作用浓度-反应曲线Fig. 2 Concentration-response fitting curves for each of the mixtures

表2 单一化合物和混合物浓度-反应关系曲线方程参数和EC50(95%CI)Table 2 The corresponding best-fit models with estimated parameters, and the estimated EC50 values and the 95% confidence intervals

图3 各种混合物实验结果与相加作用模型预测结果比较Fig. 3 Comparison between the observed and addition models predicted mixture effects

2.2 混合物实验结果与相加作用模型预测结果的比较

根据17β-雌二醇(17β-estradiol, E2)、邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(diethylhexyl phthalate, DEHP)、邻苯二甲酸二丁酯(dibutyl phthalate, DBP)单独作用的浓度-反应回归方程，应用浓度相加(CA)和独立作用(IA)模型对这3种化合物的等毒性固定浓度比例混合物效应进行预测，以单个化合物最优化非线性回归方程为基础，分别计算从1%到99%的35个效应点在满足CA和IA模型条件下的混合物效应浓度。将混合物实验数据拟合的曲线及95%置信限，与CA和IA模型预测曲线画在一张图中进行比较，如图3，可知：4个混合物应用IA模型预测出的混合物效应基本上能够落在混合物实测效应的95%置信区间内，CA模型得出的效应浓度值偏高，提示此3种化合物联合作用应用IA模型预测，CA模型会低估混合物效应，证明了3种化合物在本实验中呈现独立联合作用。3种化合物在较低暴露浓度(1/20 EC50)下，单独存在产生的效应以及联合存在时产生的混合物效应结果如图4，表明化合物单独存在时产生的效应可能不显著，但每个化合物根据其作用大小都会对总效应产生贡献，甚至在低于有效作用浓度下产生显著的混合物效应。

3 讨论(Discussion)

本研究采用体外人乳腺癌MCF-7细胞增殖实验(E-screen assay)，检测环境化合物的雌激素活性。实验结果表明，E2单独作用对MCF-7细胞增殖影响具有浓度-反应关系，E2在1 nmol·L-1时，细胞增殖效应最大，但是随着浓度的增大，在高浓度时，E2抑制细胞增殖；外源性化合物DEHP和DBP的增殖效应与内源性雌激素E2的相似，在设定浓度范围内其浓度-反应曲线均呈“S”型，但是产生的雌激素活性相对较弱，DEHP和DBP的半效应浓度EC50分别为1.186 μmol·L-1、5.138 μmol·L-1。至今为止大部分的体内实验结果认为DBP无雌激素活性，DEHP可以改变子宫湿重，但是结果不稳定，可重复性差，猜测体内体外实验的不一致性的原因可能是DBP和DEHP在体内被代谢分解，体内实验表现的是代谢产物的雌激素活性[16-17]；体外实验表现的是DBP和DEHP原型的活性。虽然在本研究中DBP和DEHP对MCF-7细胞增殖的影响均表现出较弱的雌激素活性，但是邻苯二甲酸酯类化合物对生物有机体的生殖内分泌毒性和胚胎发育毒性是不容忽视的[1-3,18]。

环境雌激素多以混合状态存在，且无论在环境中还是在生物体内均是与天然雌激素共同发挥作用，并且内源性雌激素和外源性环境雌激素污染物联合作用，产生的混合效应大于单独作用的结果[19]。因此，对E2与其他化合物共存时的雌激素活性进行研究，符合机体受环境雌激素干扰的实际情况[20]。多种化合物混合效应相较于单独作用产生的效应更复杂，这也正是研究环境雌激素混合物效应的意义所在。

图4 3种化合物低剂量(1/20 EC50)的混合物效应Fig. 4 Mixture effects at low-effect concentrations (one-twentieth of EC50) of three chemicals

本文在化合物单独作用的实验基础上，探讨雌二醇和邻苯二甲酸酯化合物的联合雌激素活性，主要结论如下：E2、DEHP和DBP浓度-反应关系曲线非线性，均为Weibull模型拟合度最优；内源性雌激素E2对MCF-7细胞的促增殖能力最强，外源性化合物的雌激素活性相对较弱；化合物在较低浓度下可能产生显著的混合物效应，外源性环境雌激素与内源性雌激素联合作用产生的混合效应显著；3种化合物表现非相似联合作用，混合物效应利用独立作用(IA)模型预测较为可靠。

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◆

ModelAssessingfortheCombinationEffectsofEstrogenicActivityofPhthalates

He Ying1, Zhang Hui1,*, Zhen Shiqi2, Zhang Lijuan1, Cao Chicheng1, Zhang Qi1

1. Key Laboratory of Environmental Medicine and Engineering of Ministry of Education, School of Public Health, Southeast University, Nanjing 210009, China2. Institute of Food Safety and Evaluation, Jiangsu Provincial Center for Disease Control and Prevention, Nanjing 210009, China

10.7524/AJE.1673-5897.20170422001

2017-04-22录用日期2017-05-31

1673-5897(2017)3-739-08

X171.5

A

张晖(1968-)，女，副教授,硕士生导师，研究方向为环境医学，发表学术论文20余篇。

中央高校基本科研业务费(2242017K40041)；东南大学研讨通选课程项目(1125000131；1125001508)

何颖(1993-)，女，硕士,研究方向为环境卫生学，E-mail: molahe@163.com;

*通讯作者(Corresponding author)， E-mail: 13851553232@163.com

何颖, 张晖, 甄士琪, 等. 邻苯二甲酸酯类雌激素活性联合作用模型分析[J]. 生态毒理学报，2017, 12(3): 739-746

He Y, Zhang H, Zhen S Q, et al. Model assessing for the combination effects of estrogenic activity of phthalates [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(3): 739-746 (in Chinese)