菲和铬(Ⅵ)单一及复合暴露对土壤微生物多样性的影响

胡双庆，沈根祥,*，顾海蓉，赵庆节，汪杏，张鸿飞

1. 上海市环境科学研究院，上海 2002332. 东华大学环境科学与工程学院，上海 2016203. 上海应用技术大学化学与环境工程学院，上海 201418

菲和铬(Ⅵ)单一及复合暴露对土壤微生物多样性的影响

胡双庆1，沈根祥1,*，顾海蓉1，赵庆节1，汪杏2，张鸿飞3

1. 上海市环境科学研究院，上海 2002332. 东华大学环境科学与工程学院，上海 2016203. 上海应用技术大学化学与环境工程学院，上海 201418

有机物和重金属已成为我国土壤环境中常见的2类污染物质，二者间复合污染引起的土壤生态环境风险不容忽视。本研究以多环芳烃模式物菲和典型重金属铬(VI)作为受试物质，采用PCR-DGGE分子指纹图谱技术，探讨这2种污染物单一及复合暴露对土壤微生物群落多样性的影响，并选用主成分分析、聚类分析和戴斯系数3种算法对微生物群落相似性进行了比较。结果表明，在暴露实验第1天，菲单一暴露低浓度组中微生物群落相似性产生了极为明显的变化，而到第7天时，菲和铬(VI)单一暴露高浓度组均对微生物群落结构相似性产生最大程度的影响；采用香农指数法评价微生物群落的多样性，发现在暴露实验第7天，菲和铬(VI)单一暴露高浓度组对微生物群落多样性的影响比复合暴露高浓度组更强，二者复合暴露的相互作用方式表现为拮抗效应。本研究证明低浓度菲短期暴露的效应高于高浓度暴露结果，因而多环芳烃菲自身及其在复合暴露中所扮演的角色尤其值得关注。

菲；铬；微生物多样性；PCR-DGGE

Received11 January 2017accepted20 February 2017

Abstract: Organic pollutants and heavy metals are ubiquitously detected in Chinese soils, and the combined contaminative effect on the ecological risks of soil environment is of great concern. Individual and combined exposure to typical PAH pollutants phenanthrene and heavy metallic pollutants chromium(VI) was conducted to investigate their effect on the diversity of soil microbial community composition. Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) of polymerase chain reaction (PCR) amplicons of 16S rDNA sequence of microorganisms in soils was used in this work. The similarity of microbial community structure was assessed using primary component analysis, clustering analysis, and Dice coefficients, respectively. Individual exposure to low-concentration of phenanthrene resulted in a significant impact on community similarity at day 1; individual exposure to phenanthrene and chromium(VI) with high-concentration manifested the maximum effect on community similarity at day 7. Shannon index was utilized to evaluate the species diversity, and the results showed that individual exposure to either phenanthrene or chromium(VI) with high-concentration resulted in greater effects than that of combined exposure to phenanthrene and chromium(VI) at day 7. Antagonism effect was identified within the combined exposure process. Our results revealed that the short-term exposure to phenanthrene with lower concentration led to greater effect than that of with higher concentration. Particular concern should be addressed to PAH compound per se, e.g. phenanthrene, and its potential effect in combined exposure processes.

Keywords: phenanthrene; chromium(Ⅵ); microbial diversity; PCR-DGGE

土壤是动物、植物和微生物赖以生存的重要环境，研究发现土壤微生物是用来表征土壤质量变化最敏感、最具潜力的指标[1]。土壤微生物在生物地化循环中占有关键地位，对于进入土壤环境外源污染物的迁移、转化起着极为重要的作用，反之，污染物的种类、浓度和毒性也会影响土壤微生物的生态特征[2]。据估计，有90%的污染物会最终残留在土壤中[3]，受到污染物质的胁迫后，土壤微生物的种群数量及其结构将发生改变。因而，利用土壤微生物多样性变化，从分子生物学水平反映污染物的影响程度及其机制[4-5]，已成为当前研究热点。

微生物群落结构和遗传多样性研究常常采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)方法[6-8]，它是将片段大小相同但核酸碱基组成和排列不同的DNA进行分离的一种分子生物学技术。在环境污染物对土壤微生物群落结构影响方面，已有不少学者报道了采用PCR-DGGE技术的研究结果，如姜允斌等[9]应用该技术研究了多环芳烃芘污染对土壤微生物产电信号的影响，发现芘能够抑制发电细菌的活性，改变土壤发电细菌的种群数量和群落结构。Bamborough等[10]采用DGGE图谱分析和聚类分析，研究了重金属锌和铅污染以及季节性更替对土壤细菌和放线菌群落结构的影响。Deng等[11]为研究工业区附近耕地土壤受重金属复合污染程度，利用该技术分析了耕地土壤植物根际微生物种群丰富度、生物群落结构和多样性。但目前，重金属-有机物复合污染对土壤微生物多样性影响的报道仍然较少。

本研究以多环芳烃模式物菲和典型重金属铬(VI)为受试物质，通过采集稻田土开展室内模拟暴露实验，利用PCR-DGGE技术研究二者单一及复合暴露对土壤微生物多样性的影响，以期为复合污染场地的生态风险评价提供理论依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验材料

供试土壤为上海市青浦现代农业园区稻田土，土壤为青紫泥，其基本理化性质见表1。采集0～20 cm表层土样，剔除植物残根、石砾等杂物，经风干、磨碎后通过1 mm筛，保存备用。

受试物质重铬酸钾、菲均为分析纯，购自中国医药(集团)上海化学试剂公司；尿素为分析纯，购自生工生物工程股份有限公司；过硫酸铵为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；琼脂糖购自Amresco公司；40%双丙烯酰胺购自Bio-Rad公司；50×TAE缓冲液购自Invitrogen公司；甲酰胺、四甲基乙二胺购自Sigma公司；2×Mix购自Biolinker公司；DNA Marker购自Takara公司。

表1 供试土壤基本理化性质Table 1 Physical and chemical properties of soils tested

1.2 菲和铬(Ⅵ)单一及复合暴露实验

根据前期开展的土壤微生物酶活性实验结果[12]，菲和铬(VI)单一暴露均设置50、800 mg·kg-12个浓度，二者按1∶1复合暴露的浓度梯度为100、200、400、800、1 600 mg·kg-1，同时设置空白对照组。每一处理组加入50 g过筛干土，重铬酸钾按照不同浓度梯度所需质量称好，溶解于去离子水，配制成溶液加入到土壤中，用玻棒反复搅拌土壤10～15 min，使重铬酸钾在土壤中均匀分布，再加入去离子水使其达到土壤干重的60%左右，然后充分混匀。对于难溶于水的有机物菲，先加入适量丙酮作为助溶剂，配制成母液加入到土壤中，用玻棒充分混匀，放入通风橱中使丙酮充分挥发，再加入去离子水使其达到土壤干重的60%左右，然后混合均匀。将处理好的土样放入150 mL烧杯中，然后置于24 ℃人工气候箱中恒温培养。在1 d、5 d、7 d取样进行PCR-DGGE分析。

1.3 土壤微生物DNA提取纯化和PCR扩增

从各处理组中称取0.5 g土壤样品至裂解管中，加入978 μL磷酸缓冲液，涡旋10～15 s，再加入122 μL MT缓冲液，涡旋1 min，14 000×g离心10 min。将上清液转移至2 mL EP管中，加入250 μL的PBS，手摇10次，室温下放置10 min。离心5 min后取上清液至2 mL EP管中，加入等体积Binding Matrix，手摇混匀3～5 min。取800 μL溶液至SPINTM过滤器中，离心5 min后去除收集管中的滤液，再将剩余溶液按上述操作重复进行，去除收集管中的滤液，加入500 μL SEWS-M至SPINTM过滤器中，轻轻振摇混合，离心5 min，去除滤液后再次离心5 min去除剩余溶剂。更换收集管，室温下干燥5 min，加入100 μL DES至SPINTM过滤器中，轻轻振荡悬浮液，室温下放置5 min，然后离心2 min，收集滤液放于-20 ℃冰箱中保存至使用。

将提取的基因组DNA作为PCR模板，选择细菌16S rDNA V3区引物357-F-GC(5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGG GCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和517R(5′- ATTACCGCGGCTGCTGG-3′)进行扩增。

PCR采用40 μL反应体系：2×Taq BioLinker Mix 20 μL，引物上游、下游各1 μL，模板5 μL，补足灭菌双蒸水至40 μL。扩增条件：94 ℃预变性2 min；然后30个循环为94 ℃、30 s，56 ℃、30 s和72 ℃、30 s；最后72 ℃延伸5 min。复原条件PCR采用40 μL反应体系：2×Taq BioLinker Mix 20 μL，引物上游、下游各2 μL，模板4 μL，补足灭菌双蒸水至40 μL。扩增条件：94 ℃预变性2 min；然后5个循环为94 ℃、30 s，56 ℃、30 s和72 ℃、30 s；最后72 ℃延伸5 min。16S PCR产物各取3 μL于1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 PCR反应产物的DGGE分析

取20 mL 40% (m/V)双丙烯酰胺，2 mL 50×TAE缓冲液，用双蒸水定容至100 mL，制备成0%变性剂母液。取20 mL 40%双丙烯酰胺，2 mL 50×TAE缓冲液，32 mL甲酰胺，33.6 g尿素，用双蒸水定容至100 mL，制备成80%变性剂母液。16S DGGE变性梯度范围在60%～78%。

将 Bio-Rad制胶装置倾斜放，通过灌胶系统以从顶部注入凝胶的填充方式进行梯度灌胶。下层胶凝固1～1.5 h后，灌上层0%胶。凝胶灌制完毕后，插入梳子，放置1～1.5 h，待胶凝固后移除梳子。将凝胶装置放入Bio-Rad水浴系统中，电泳缓冲液1×TAE，70 V电压，温度保持在60 ℃，电泳15.5 h。电泳结束后，关闭电源取出凝胶装置，放在磁钢容器中，加入400 mL Biolinker DNA Red染色液进行染色40 min，然后置于Bio-Rad凝胶成像系统中观察拍照。

1.5 数据统计分析

采用香农指数(Shannon)来表征土壤样品中微生物群落的多样性，该指数的值越大，表明微生物群落多样性越高。

公式中：H为香农指数，S为DGGE胶中条带数量，Pi为第i条带灰度占该样品总灰度的比率。

利用Quantity One软件(Bio-Rad Inc.)对DGGE凝胶电泳图进行胶条带检测。采用Microsoft Excel软件对数据进行统计分析和作图。

2 结果(Results)

2.1 土壤基因组DNA质量控制

暴露实验开始后的第1、5和7天，对土壤样品微生物进行基因组DNA质控检测，琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。其中编号0～9、10～19、20～29分别为第1、5和7天的暴露实验浓度组，浓度顺序均为空白对照、铬(VI)单一50 mg·kg-1、菲单一50 mg·kg-1、铬(VI)和菲1∶1复合100、200、400、800、1 600 mg·kg-1、铬(VI)单一800 mg·kg-1、菲单一800 mg·kg-1。Marker从上到下依次为9 000 bp、5 000 bp、3 000 bp、2 000 bp、1 000 bp、500 bp，其中亮带为30 ng·μL-1，其余为10 ng·μL-1。由于土壤微生物基因组DNA条带部分清晰可见，表明其质量合格可直接用于后续实验。

2.2 PCR产物检测

根据土壤基因组DNA质量控制结果，分别在第1、5和7天对土壤样品微生物基因组DNA进行PCR扩增及复原条件扩增，16S PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图2和图3所示。其中M为DL 2000 Marker，从上到下依次为2 000 bp、1 000 bp、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp，其中亮带为20 ng·μL-1，其余为10 ng·μL-1，以下所用Marker均为DL 2000。从图中可以看出，PCR产物条带单一，大小正确，浓度适中。调整产物上样量后可继续进行DGGE电泳。

2.3 土壤微生物群落DGGE电泳结果

由于DGGE电泳具有强大的分离能力，能对长度相同而序列不同的16S rDNA进行分离，且条带信号越亮表示该种细菌数量越多[13-14]，因而从微生物群落条带分布图(见图4)可清晰地看出，样品土壤含有较为丰富的微生物物种，其群落结构比较复杂。从对照组的情况看，尽管从第1天到5天，微生物物种丰富度有所上升，但到7 d时菌种数量反而有所下降，部分优势菌种有所显现。菲和铬(VI)单一及复合暴露改变了土壤微生物群落的结构，引起菌种数量和优势菌种发生不同程度的变化。

2.4 微生物群落主成分分析

菲、铬(VI)单一及复合暴露下土壤微生物群落结构的主成分分析如图5所示，可以发现在暴露第1天，铬(VI)单一低浓度暴露组(编号1)对菌群结构的影响比较小，与对照组(编号0)相似度较高；而菲单一低浓度暴露组(编号2)则对群落结构影响较大。第7天时，菲和铬(VI)复合暴露对微生物群落的影响趋向于一致，均不十分明显，而这2种污染物单一暴露的高浓度组(编号28和29)相差极大，影响最为显著；相对于各自单一暴露，二者复合暴露表现出一定的“抵消”特征。

2.5 微生物群落相似性聚类分析

同样以第1天和7天菲、铬(VI)单一及复合暴露土壤微生物群落结构相似性开展聚类分析(见图6)。在第1天时，铬(VI)单一低浓度暴露组(编号1)土壤微生物群落结构与对照组(编号0)相似度较高，与高浓度的复合暴露组(编号8和9)也比较相似。相比较而言，菲低浓度单一暴露(编号2)和最低浓度的复合暴露组(编号3)差异最大。因此，第1天时发生树的分析结果与主成分分析结果比较一致，但在第7天时，发生树结果与主成分结果出现一些不同。

图2 不同暴露浓度组土壤微生物16S PCR产物的电泳检测结果Fig. 2 Agarose gel electrophoresis for 16S PCR product in the soil microorganisms exposed to different test groups

图3 不同暴露浓度组土壤微生物16S PCR产物复原条件扩增的电泳检测结果Fig. 3 Agarose gel electrophoresis for 16S reconditioning PCR product in the soil microorganisms exposed to different test groups

图4 土壤微生物群落的条带分布和强度示意图Fig. 4 Strip distribution and intensity representing soil microbial community

图5 土壤微生物群落的主成分分析图Fig. 5 Primary component analysis of soil microbial community

图6 不同组别样品土壤微生物群落相似性聚类分析Fig. 6 Clustering analysis of soil microbial community from different samples

表2 菲和铬(VI)单一及复合暴露第1天的戴斯系数值Table 2 Dice coefficients of individual and joint exposure of phenanthrene and chromium(VI) on day 1

2.6 微生物群落戴斯系数分析

表2和表3分别代表利用戴斯系数分析不同暴露方式在第1天和7天对土壤微生物群落结构的影响。在第1天时，戴斯系数分析与主成分分析和发生树分析结果均比较一致，对照组(编号0)主要与编号1、8和9组别样品相似；而在第7天时，戴斯系数分析的结果相对而言更类似于主成分分析结果。

2.7 微生物群落多样性的香农指数

衡量微生物群落多样性的指标包括香农指数、均匀度指数、丰富度指数和辛普森指数等[15-17]，这里使用香农指数作为代表性指标分析暴露后土壤微生物群落的生物多样性。通过分析第1、5和7天各组别土壤微生物群落的香农指数，结果如图7所示。可以发现，暴露持续到第5和7天时，菲和铬(VI)高浓度单一暴露对土壤微生物群落的影响最大，程度甚至超过最高浓度的复合暴露组(暴露浓度为2个单一暴露组的浓度和)，再次印证了菲和铬(VI)复合暴露在高浓度下可能发生拮抗效应。

3 讨论(Discussion)

采用3种算法对菲和铬(VI)单一及复合暴露下土壤微生物群落结构进行了比较分析，其规律性结果总结如下：第1天时，低浓度铬(VI)单一暴露对微生物群落结构的影响较为轻微，相似性与对照组较高，然而低浓度菲单一暴露却迅速影响了土壤微生物群落结构；至第7天时，高浓度菲和铬(VI)单一暴露相较于二者复合暴露，对微生物群落结构产生更加剧烈的影响，这与二者复合污染对土壤酶活性表现为的拮抗作用[12]相一致，分析原因可能与二者相互干扰微生物生理活动及生物大分子的合成有关[18]；各浓度复合暴露在第1天时与2种污染物单一暴露的微生物群落相似性没有明显差别，但在第7天时更类似于菲单一暴露微生物群落多样性呈现出的结果。

图7 不同组别样品的香农指数对比注：50 Cr(VI)表示50 mg·kg-1 Cr(VI)，50 Phe表示50 mg·kg-1菲，50 Cr(VI) 50 Phe表示50 mg·kg-1 Cr(VI)和50 mg·kg-1菲联合暴露，余同。Fig. 7 The comparison of Shannon index among different samplesNote: 50 Cr(VI) indicated individual exposure to 50 mg·kg-1 Cr(VI); 50 Phe indicated individual exposure to 50 mg·kg-1 phenanthrene; 50 Cr(VI) 50 Phe indicated joint exposure to 50 mg·kg-1 Cr(VI) and 50 mg·kg-1 phenanthrene. The same below.

表3 菲和铬(VI)单一及复合暴露第7天的戴斯系数值Table 3 Dice coefficients of individual and joint exposure of phenanthrene and chromium (VI) on day 7

有研究表明，不同浓度的重金属对微生物影响各异，但高浓度重金属对大多数微生物具有毒性效应[19]。Li等[20]对Cu、Zn冶炼厂周围土壤采样并用PCR-DGGE分析，发现微生物多样性随重金属浓度增加而降低。Joynt等[21]研究发现，受Pb、Cr污染40年左右的场地，土壤微生物群落结构虽然发生改变，但仍保留了种群系统多样性。在高浓度重金属存在下，某些微生物仍能存活或生长，是因为微生物对污染物产生抗性，有些菌还可通过生物转化作用或生理代谢活动使重金属由高毒状态变为低毒状态[22]。

从土壤微生物群落结构的变化来看，多环芳烃菲自身及其在复合暴露中所扮演的角色尤其值得关注，低浓度菲短期暴露的效应可能反而高于高浓度暴露结果。沈国清等[23]研究发现，50 mg·kg-1菲暴露已可对土壤中的细菌、真菌和放线菌产生约50%的抑制率。而在另一项研究中，2 000 mg·kg-1的菲暴露在第4天时也不会对细菌总量产生显著影响[24]。

PCR-DGGE是一种高度敏感的DNA指纹图谱技术，但是它本身缺乏对微生物种属的鉴定能力[25]。因此，需要将电泳后的优势条带切胶回收后，通过16S测序获得优势条带相对应微生物的序列信息，再利用BLAST工具对菌种进行比对识别。通过识别优势菌种构成及其变化，将有利于更深入地理解菲和铬(VI)对土壤生态环境的污染机制。

综上所述，菲和铬(VI)单一及复合暴露均会对土壤微生物群落结构的多样性和相似性产生影响，二者复合暴露的相互作用方式表现为拮抗效应，研究结果可为多环芳烃和重金属复合污染场地的生态风险评价提供重要参考依据。

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EffectsofSingleandCombinedExposuretoPhenanthreneandChromium(Ⅵ)onMicrobialDiversityinSoils

Hu Shuangqing1, Shen Genxiang1,*, Gu Hairong1, Zhao Qingjie1, Wang Xing2, Zhang Hongfei3

1. Shanghai Academy of Environmental Sciences, Shanghai 200233, China2. College of Environmental Science and Engineering, Donghua University, Shanghai 201620, China3. School of Chemical and Environmental Engineering, Shanghai Institute of Technology, Shanghai 201418, China

10.7524/AJE.1673-5897.20170111003

2017-01-11录用日期2017-02-20

1673-5897(2017)3-535-09

X171.5

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沈根祥(1965—)，男，环境工程博士，教授级高级工程师，主要研究方向生态毒理学和农村环境保护。

上海市2014年度“科技创新行动计划”社会发展领域项目(14231200500)

胡双庆(1978-)，男，博士，高级工程师，研究方向为生态毒理学，E-mail: husq@saes.sh.cn；

*通讯作者(Corresponding author)， E-mail: shengx@saes.sh.cn

胡双庆, 沈根祥, 顾海蓉, 等. 菲和铬(Ⅵ)单一及复合暴露对土壤微生物多样性的影响[J]. 生态毒理学报，2017, 12(3): 535-543

Hu S Q, Shen G X, Gu H R, et al. Effects of single and combined exposure to phenanthrene and chromium (Ⅵ) on microbial diversity in soils [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(3): 535-543 (in Chinese)