3种方法治疗肠道菌群失调合并过敏性哮喘大鼠对肠道菌群的影响

付 雯，刘兴隆，张珑琼，高永翔

(成都中医药大学 610075)

论著·基础研究doi:10.3969/j.issn.1671-8348.2017.25.007

3种方法治疗肠道菌群失调合并过敏性哮喘大鼠对肠道菌群的影响

付 雯，刘兴隆，张珑琼，高永翔△

(成都中医药大学 610075)

目的根据“肺与大肠相表里”的理论，为肺肠合治法治疗肠道菌群失调并过敏性哮喘提供理论依据。方法实验共分了空白组、模型组、阳性组和3种中药复方的给药组；采用头孢哌酮加白色念珠菌灌胃SD大鼠的方式复制肠道菌群失调，并在此基础上运用卵清清蛋白注射致敏与雾化诱发哮喘，雾化同时分别给予加味升降散、桂枝加厚朴杏子汤和增液承气汤药液从肺肠合治、治肺和治肠进行治疗；采用Buxco全身体积描记系统分析呼吸功能，通过16SrDNA分析肠道菌群的变化。结果根据OTU值分析各组肠道菌群物种组成发现，各组对乳酸杆菌的恢复接近空白组且优于阳性组，3个治疗组均可促进变形菌门和拟杆菌门菌群的恢复，但肺肠合治效果最佳，通过Alpha 多样性分析发现肠道微生物菌群多样性从高到低分别是治肠组、治肺组、肺肠合治组、模型组；呼吸频率和气道高反应性模型组为260.56(1.28)，治疗后肺肠合治组、治肺组和治肠组分别为141.79(0.93)、137.25(1.30)和203.16(0.84)，各治疗组大鼠呼吸频率均低于模型组，而气道高反应性只有肺肠合治组和治肠组低于模型组且差异有统计学意义(P<0.05)。结论肺肠合治法治疗肠道菌群失调合并过敏性哮喘大鼠在肺功能和肠道菌群恢复上优于单纯治肠或治肺法。

哮喘；肠道菌群；中医治疗学

过敏性哮喘(allergic asthma)是由多种细胞特别是肥大细胞、嗜酸性粒细胞和T淋巴细胞参与的慢性气道炎症[1]。大量研究表明哮喘患者的肠道菌群多样性均发生变化，提示过敏性哮喘与肠道菌群的多样性关系密切[2-3]；临床研究也发现，在利用常规手段治疗过敏性哮喘患者同时调节患者的肠道菌群，恢复肠道微生态，可提高过敏性哮喘的治疗效果，而且复发率更低[4]。中医认为：“肺与大肠相表里，肺病及肠，肠病亦可及肺”[5]。现代医学研究也表明肺与肠关系密切，并且二者均参与了公共黏膜免疫系统的构成。因此，本研究基于“肺与大肠相表里”的理论，笔者提出在治法上分别从肺肠合治、治肺、治肠治疗肠道菌群失调合并过敏性哮喘大鼠，研究3种治法对模型大鼠肠道菌群和呼吸功能的影响，为中医治疗肠道菌群失调合并过敏性哮喘提供实验依据。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF级SD大鼠50只，雄性，体质量(200±20)g，购于简阳达硕动物科技有限公司，许可证号：SCXK(M)2008-15(川)。SD大鼠饲养于标准大鼠塑料笼中，动物自由进食及饮用生活饮用水。动物房温度20～24 ℃，相对湿度40%～70%，空气流通。

1.2仪器与试剂 头孢哌酮(华北制药河北华民药业有限责任公司，批号PC5130301)；枯草芽孢杆菌二联活菌(后简称妈咪爱，北京韩美药品有限公司，批号20131250)；氨茶碱(西南药业股份有限公司，批号20140302)；QIAamp DNA Stool Mini Kit(Qtagen，批号145050844)；白色念珠菌(广东环凯微生物科技有限公司，批号A0081B)；ELISA Kit for sIgA(上海一研生物科技有限公司，批号LOT201411)。

1.3各组处理方案及模型构建方法

1.3.1空白组 适应性喂养结束后，以无菌水代替生活饮用水，生理盐水代替卵清清蛋白(OVA)进行灌胃、注射致敏和雾化吸入。

1.3.2模型组 适应性喂养结束后，给予SD大鼠0.5 g/L的头孢哌酮水溶液，自由饮用，连续处理5 d。第6天将生活饮用水换成无菌水，同时单次灌胃109cfu/mL的白色念珠菌50 μL，使其定植肠道，以进一步加重肠道菌群失调。将配制好的OVA凝胶致敏剂，分别于第0天和第7天于大鼠双侧胸部和腹股沟共4点皮下注射各0.15 mL，同时腹腔注射0.40 mL，共1.00 mL。第14天开始将大鼠置于10 cm×10 cm×20 cm有机玻璃盒内，超声雾化吸入1% OVA以诱发哮喘，每天1次，每次30 min，连续7 d。

1.3.3阳性组 造模后从激发当天开始以妈咪爱+氨茶碱灌胃，连续7 d。

1.3.4给药组 造模后，从激发当天开始3种方药根据成人每日中药的服用量，依据《药理实验方法学》人和鼠之间体积比换算系数进行换算，以换算后的剂量灌胃大鼠，连续7 d。各组药物具体灌胃方案见表1(人体质量按60 kg计算)。

表1 各组处理方案

1.4药物制备及给药方法

1.4.1桂枝加厚朴杏子汤 治肠组采用桂枝加厚朴杏子汤，桂枝9 g，炙厚朴6 g，杏仁6 g，白芍9 g，炙甘草6 g，生姜9 g，大枣3枚。

1.4.2增液承气汤 治肺组采用增液承气汤，玄参30 g，麦冬(连心)24 g，细生地24 g，大黄9 g，芒硝4.5 g。

1.4.3加味升降散 肺肠合治组采用加味升降散，炒僵蚕10 g，蝉衣6 g，姜黄10 g，酒大黄10 g，炙麻黄6 g，苦杏仁10 g，黄芩10 g，厚朴10 g。以上药物均购于成都市北京同仁堂药房，经成都中医药大学药学院李敏教授鉴定为正品，熬制成每1 mL药液含生药1 g的浓缩液，高温灭菌后冷藏备用。

1.5大鼠肠道16SrDNA的检测 根据实验分组，每组均取6只动物，根据QIAamp DNA Stool Handbook操作说明提取粪便DNA，每个样本DNA各取20 μL混合均匀。将提取的基因组DNA 送深圳华大基因科技服务有限公司，分析3个样本的肠道菌群的物种基因组成。

1.6大鼠呼吸功能测定 利用Buxco动物肺功能分析系统进行测定。

1.7肺组织标本的病理切片分析 处死大鼠，迅速沿正中线打开胸腔，取下右肺下叶，固定好肺组织并用石蜡进行包埋。最后进行常规苏木精-伊红(HE)染色处理。

1.8支气管肺泡灌洗液(BALF)、肠黏膜sIgA的检测 提取BALF和肠黏膜黏液，用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测sIgA水平。

2 结 果

2.1大鼠呼吸功能测定 模型组大鼠的呼吸频率显著高于空白组和阳性组(P<0.01)；但对于气道高反应性指标而言，3组差异无统计学意义(P>0.05),见表2。

表2 大鼠呼吸频率和气道高反应性比较

*：P<0.05，**：P<0.01，与空白组比较；▲▲：P<0.01，与阳性组比较

2.2BALF细胞的EOS计数 模型组BALF中的嗜酸性粒细胞(3.36±0.43)显著高于空白组(1.66±0.33)和阳性组(1.0±0)，差异有统计学意义(P<0.01),见表3。

A：空白组；B：模型组；C：阳性组；编号1代表放大倍数100倍，编号2代表放大倍数400倍

图1肺组织HE染色观察

2.3肺组织HE染色观察 空白组大鼠(图1A)的肺组织未见明显炎性细胞；模型组(图1B)肺组织中可见明显的炎性细胞浸润，同时气管壁增厚伴气管管腔缩小。阳性组大鼠的肺组织(图1C)炎性细胞明显少于模型组，但比空白组仍有较多炎性细胞，气管管壁增厚的状态有所缓解。

2.4BALF和肠黏膜的sIgA水平 模型组BALF中的sIgA水平显著低于空白组(P<0.05)；同时肠黏膜中sIgA的水平模型组显著低于空白组、阳性组(P<0.01、P<0.05)，见表3。

表3 BALF和肠黏膜中sIgA的水平(n=8)

*：P<0.05，**：P<0.01，与空白组比较，▲：P<0.05，与阳性组比较

2.5大鼠肠道16SrDNA的分析

2.5.1OTU及其丰度分析 各处理组内的物种丰度可通过OTU初步反映。模型组肠道菌群的物种丰度分别比治肠组和治肺组低10.82%和13.6%，但高于肺肠合治组。

2.5.2物种及其丰度分析 将不同样品的物种根据OTU值，按照门、纲、目、科、属进行分类，并跟数据库的数据进行比对，做出各样品物种profiling的柱状图。模型组的肠道乳酸杆菌比治肠组、治肺组和肺肠合治组分别低86.88%、77.2%和74.69%，而且3个治疗组跟阳性组相比，分别高了82.7%、82.6%和80.72%；模型组的变形菌门数量比治肠组、治肺组和肺肠合治组分别低13.4%、29.69%和80.4%，见图2。

图2 各处理组在各分类等级上的物种profiling柱状图

2.5.3样品复杂度分析 (1)单个样品复杂性分析：模型组物种多样性最低，各治疗组的物种多样性从高到低分别是治肠组、治肺组、肺肠合治组，见表4。(2)不同样品物种组成聚类分析：在物种组成相似性上，肺肠合治组、治肺组和模型组最接近，阳性组和治肠组则跟模型组距离稍远，空白组距离其他5组均较远。

2.6大鼠呼吸功能测定 呼吸频率空白组为(119.07±19.41)次，模型组(260.56±36.94)次，阳性组(153.05±14.65)次，肺肠合治组(141.79±28.88)次，治肺组(137.25±26.37)次，治肠组(203.16±17.52)次。各治疗组大鼠呼吸频率均显著低于模型组(P<0.01)，而且治肺组与肺肠合治组跟空白组的差异无统计学意义(P>0.05)。气道高反应性空白组0.95±0.21，模型组1.28±0.09，阳性组1.07±0.11，肺肠合治组0.93±0.12，治肺组1.3±0.44，治肠组0.84±0.16，肺肠合治组和治肠组均低于模型组且差异有统计学意义(P<0.05)，其他各组差异无统计学意义(P>0.05)。

表4 样品Alpha多样性统计结果

observed species、chao、ace指数：反映样品中群落的丰富度； shannon、simpson指数：反映群落的多样性

3 讨 论

本实验分别从肺肠合治、治肺和治肠三个角度利用加味升降散、桂枝加厚朴杏子汤、增液承气汤治疗肠道菌群失调合并过敏性哮喘大鼠。选方依据：桂枝加厚朴杏子汤首载于《伤寒论·辨太阳病脉证并治》第18条“喘家作，桂枝汤，加厚朴、杏子佳”与第43条“太阳病，下之，微喘者，表未解故也，桂枝加厚朴杏子汤主之。”此方是中医“伤寒论”中治疗哮喘病症的经典方之一，同时已有许多研究表明此方可以治疗哮喘。廖伟平[6]利用加减该方的方法治疗变异型哮喘患者35例，试验结果表明治疗组显效率88.6%，对照组(常规西药)显效率53.3%；而1年后复发率治疗组为14.3%，对照组为40.0%，可见该方治疗效果显著优于对照组，因此作为从肺治疗的方药；《温病条辨·中焦篇》第17条指出：“阳明温病，下之不通，其证有五……津液不足，无水舟停者，间服增液，再不下者，增液承气汤主之。”增液承气汤具有滋阴增液，泄热痛便的功效。肖阳娥等[7]利用该方治疗40例慢性呼吸衰竭患者发现，中医治疗组有效率达到82.5%，而对照组仅56.6%，差异有统计学意义(P<0.05)。王爱华[8]利用该方治疗喘证患者，发现患者服用10剂后即康复。根据“肺与大肠相表里”理论，增液承气汤可以承气清热、增液益津，从而达到化痰降气平喘的功效，因此作为从肠治肺的方药；升降散源于明代医家张鹤腾编著的《伤暑全书》，后得清代医家杨粟山发挥载于《伤寒瘟疫条辨》[9]。该方以僵蚕为君，蝉蜕为臣，姜黄为佐，大黄为使，米酒为引，蜂蜜为导。鲁恒心[10]研究发现利用升降散加减治疗咳嗽变异型哮喘38例，有效率高达92.11%；靳文学等[11]利用加味升降散治疗过敏性哮喘豚鼠，结果表明加味升降散可下调哮喘豚鼠肺内sIgA的高免疫状态。笔者在主方基础上，加了炙麻黄、苦杏仁、黄芩和厚朴。麻黄和杏仁加强了该方的升降作用；黄芩清肺解毒，泄肺之郁热；厚朴下气平喘，通畅腑气，作为肺肠合治的方药。

本实验结果显示，所有治疗组肠道菌群中正常菌群的数量均有不同程度的提高，有害菌群数量降低，但是对于肠道微生物菌群多样性的恢复，治肠组优于其他两组。但肺肠合治组对变形菌门和拟杆菌门的恢复效果最佳，说明肺肠合治法对于肠道优势菌种的恢复比单纯治肠法更有优势。升降散的应用目前国内主要集中在呼吸道疾病或外感发热等疾病上[12-13]。本实验发现该方对肠道菌群的恢复具有疗效，还可应用于肠道疾病的治疗。

对于改善过敏性哮喘的典型症状呼吸频率和气道高反应性而言，3组均能有效地降低呼吸频率，但只有肺肠合治组对气道高反应性也有比较好的改善作用，说明肺肠合治法在对过敏性哮喘呼吸功能的恢复上优于单纯治肺法和单纯治肠法。这与国内其他学者利用肺肠合治法治疗过敏性哮喘的实验结果一致[14]。

综上所述，肺肠合治的治疗方法对于治疗肠道菌群失调合并过敏性哮喘大鼠在肺功能和肠道菌群恢复上都具有明显的优势和疗效，可作为治疗该病的首选治疗方案，为中医治疗肠道菌群失调合并过敏性哮喘提供了实验依据。治肠方在肠道菌群多样性的恢复上具有明显优势，而且治肺组对肠道致病菌梭状芽孢杆菌的抑制作用最优，因此可通过重新配伍的方法找到一个更优的肺肠合治方。

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Influenceofthreedifferenttherapeuticmethodsonintestinalfloraintreatingratintestinaldysbacteriosiscomplicatingallergicasthma*

FuWen,LiuXinlong,ZhangLongqiong,GaoYongxiang△

(ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu,Sichuan610075,China)

ObjectiveTo provide a theoretical basis for the pulmonary enteric therapy in treating intestinal dysbacteriosis complicating allergic asthma according to the traditional theory of "Lung and Large intestine are interiorly-exteriorly".MethodsThe experiment included the blank group,model group,positive control group and three kinds of traditional Chinese medicine compound administration group;the intestinal dysbacteriosis in SD rats was duplicated by adopting cefoperazone and candida albicans gavage.On this basis ovalbumin injection sensitization and nebulization were applied to induce asthma.Meanwhile Jia-Wei-Sheng-Jiang Powder(SJS),Guizhi-Jia-Houpu-Xingzi Decoction(GHX) and Zeng-Ye-Cheng-Qi Decoction(ZYCQ) were orally administered for treatment of lung-intestine combine therapy,lung therapy and intestine therapy.The respiratory function was analyzed by using the Buxco whole body plethysmography.The variety of intestinal flora were analyzed by using 16SrDNA.ResultsAnalyzing the specieces composition of intestinal flora in each group by the OUT value found that the recovery of Lactobacillus in each group was close to that in the blank group and better than that in the positive group,meanwhile,3 treatment groups all could promote the recovery of Proteobacteria and bacteroidetes,but the lung-intestine combine therapy had optimal effect,the Alpha diversity analysis found that the intestinal microflora diversities from high to low were in turn the intestinal therapy group,lung therapy group,lung-intestine combined therapy group and model group;the respiratory frequency and airway hyperreactivity in the model group was 260.56(1.28),which in the lung-intestine combined therapy group,lung therapy and intestine therapy after treatment were 141.79(0.93),137.25(1.30)and 203.16(0.84)respectively, the rat respiratory frequency in each treatment group was lower than that in the model group,while the airway hyperreactivity only in the lung-intestine combined therapy group and intestinal therapy group was lower than that in the model group,moreover showing statistical significance.ConclusionThe lung-intestine combine therapy method for treating rat intestinal dysbacteriosis complicating allergic asthma is superior to simple lung therapy method or intestine therapy method.

asthma;intestinal microflora;therapeutics

R256.12

A

1671-8348(2017)25-3477-03

2016-12-22

2017-07-10)

国家自然科学基金资助项目(81303085)；成都中医药大学科技发展基金资助项目(ZRYY1620)。

付雯(1983-)，博士，讲师，主要从事中西医结合基础研究。

△通信作者，E-mail:406084191@qq.com。