HPLC法同时测定牛黄宁宫片中6种成分的含量

孙艳涛，宋玉红，赵磊，于浪天，王良（1.吉林师范大学化学学院，吉林四平16000；2.吉林师范大学环境友好材料制备与应用省部共建教育部重点实验室，吉林四平 1010；.吉林省四平市食品药品检验所，吉林四平 16099；.中国药科大学中药学院，南京 211198）

HPLC法同时测定牛黄宁宫片中6种成分的含量

孙艳涛1，2＊，宋玉红1，2，赵磊3，于浪天4，王良1#（1.吉林师范大学化学学院，吉林四平136000；2.吉林师范大学环境友好材料制备与应用省部共建教育部重点实验室，吉林四平 130103；3.吉林省四平市食品药品检验所，吉林四平 136099；4.中国药科大学中药学院，南京 211198）

目的：建立同时测定牛黄宁宫片中6种成分含量的方法。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱为TC-C18，流动相为甲醇-0.05%磷酸（梯度洗脱），流速为1.0 mL/min，检测波长为280 nm，柱温为25℃，进样量为10µL。结果：甘草苷、盐酸小檗碱、连翘苷、黄芩苷、大黄素和大黄酚检测质量浓度线性范围分别为3.2～320 µg/mL（r＝0.999 9）、8.8～880 µg/mL（r＝0.999 8）、5.6～560µg/mL（r＝0.999 5）、2.0～200 µg/mL（r＝0.999 9）、4.4～440 µg/mL（r＝0.999 9）、2.0～200 µg/mL（r＝0.999 7）；精密度、稳定性、重复性试验的RSD＜6.0%；加样回收率分别为96.34%～97.25%（RSD＝0.33%，n＝6）、96.12%～98.06%（RSD＝0.82%，n＝6）、96.36%～99.09%（RSD＝1.02%，n＝6）、95.84%～97.32%（RSD＝0.65%，n＝6）、95.83%～97.92%（RSD＝0.88%，n＝6）、98.60%～99.65%（RSD＝0.42%，n＝6）。结论：该方法操作简便，精密度、稳定性、重复性好，可用于牛黄宁宫片中6种成分含量的测定。

牛黄宁宫片；高效液相色谱法；含量测定

ABSTRACTOBJECTIVE：To establish a method for simultaneous determination of 6 components in Niuhuang ninggong tablets.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on TC-C18column with mobile phase consisted of methanol-0.05%phosphate acid（gradient elution）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 280 nm，and the column temperature was 25℃.The sample size was 10µL.RESULTS：The linear ranges of glycyrrhizin，berberine hydrochloride，baicalin，baicalin，emodin and chrysophanol were 3.2-320 µg/mL（r＝0.999 9），8.8-880 µg/mL（r＝0.999 8），5.6-560 µg/mL（r＝0.999 5），2.0-200 µg/mL（r＝0.999 9），4.4-440 µg/mL（r＝0.999 9），2.0-200 µg/mL（r＝0.999 7），respectively.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 6.0%.The recoveries were 96.34%-97.25%（RSD＝0.33%，n＝6），96.12%-98.06%（RSD＝0.82%，n＝6），96.36%-99.09%（RSD＝1.02%，n＝6），95.84%-97.32%（RSD＝0.65%，n＝6），95.83%-97.92%（RSD＝0.88%，n＝6），98.60%-99.65%（RSD＝0.42%，n＝6），respectively.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate，stable and reproducible，and can be used for content determination of 6 components in Niuhuang ninggong tablets.

KEYWORDSNiuhuang ninggong tablets；HPLC；Content determination

中成药作为一个完整的制剂，强调的是各味药材的协同作用。目前，以单一有效成分或指标成分难以真正控制中成药质量。有些中成药生产企业为了降低成本，利用药检质量标准不能完全控制所有药材的漏洞，漏加、少加药材。因此，必需建立一种快速、准确、全面分离、检测中成药中多种活性成分的方法，以便更好地监控中成药质量和用药安全[1-4]。

精神分裂症是最常见和最严重的精神疾病之一[5]。牛黄宁宫片可用于外感热病、高热神昏、惊风抽搐、肝阳眩晕、耳鸣头痛、心烦不寐及癫痫狂燥的治疗，对精神分裂症有一定的抗复发作用[6-12]。牛黄宁宫片由牛黄、蒲公英、雄黄、连翘、大黄、冰片、金银花、甘草、黄连、黄芩、钩藤、大黄磁石（煅）、玄参、葛根等27味中药材经提取加工制成，该制剂收录于《中国卫生部药品标准中药成方制剂》（WS3-B-2852-98）。原质量标准中仅有简单的显微鉴别、砷量检测和胆酸含量检测[13]。专利“一种控制牛黄宁宫片质量的方法”也仅对性状鉴别、显微及薄层色谱鉴别、三氧化二砷检验和黄芩含量测定进行了控制[14]。上述方法检测指标少，有可能导致其他组分不稳定或缺乏，难以全面准确控制药品质量。目前，有关牛黄宁宫片中多个活性成分含量的测定未见报道。本试验采用高效液相色谱法（HPLC）同时测定牛黄宁宫片中6种成分的含量，为全面控制该制剂的质量提供理论基础。

1 材料

1.1 仪器

1100型HPLC仪，包括VWD检测器（美国Agilent公司）；UV-2550型紫外分光光度计（日本Shimadzu公司）；FA1104N型万分之一电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司）；SK5200H型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）。

1.2 药品与试剂

牛黄宁宫片（沈阳红药制药有限公司，批号：Z21021460，规格：0.34 g/片）；大黄素对照品（批号：110756-200110，纯度：100%）、大黄酚对照品（批号：110796-201017，纯度：100%）、连翘苷对照品（批号：110821-201112，纯度：96.8%）、甘草苷对照品（批号：111610-201106，纯度：93.7%）、黄芩苷对照品（批号：110715-201318，纯度：93.3%）、盐酸小檗碱对照品（批号：110713-201212，纯度：86.7%）均购自中国食品药品检定研究院；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：TC-C18（250 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：甲醇（A）-0.05%磷酸（B），梯度洗脱（0～35 min，10%→80%A；35～55 min，80%A；55～60 min，80%→10%A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：280 nm；柱温：25 ℃；进样量：10µL。在上述色谱条件下，理论板数以甘草苷、盐酸小檗碱、黄芩苷、连翘苷、大黄素和大黄酚峰计均＞3 000；保留时间分别为21.73、23.05、25.96、27.74、43.20和44.28 min，各成分基线分离良好，详见图1。

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 精密称取待测成分对照品各适量，分别置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，称定质量，超声（功率：200 W，频率：59 kHz，下同）处理30 min，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，制成甘草苷、盐酸小檗碱、黄芩苷、连翘苷、大黄素、大黄酚质量浓度分别为200、800、560、320、200、440 µg/mL的单一对照品溶液。分别精密量取上述单一对照品溶液适量，置于5 mL量瓶中，加甲醇定容，即得。

2.2.2 供试品溶液 取样品若干，除去糖衣，用玻璃研钵研细，精密称取0.038 14 g，置于5 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，称定质量，超声处理45 min，再次称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，静置24 h，滤过，即得。

2.3 线性关系考察

精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液0.1、0.5、1、2、4、5、6、7、8、9、10 μL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测成分质量浓度（x，μg/mL）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，回归方程与线性范围见表1。

表1 回归方程与线性范围Tab 1 Linear equations and linear ranges

2.4 精密度试验

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果，甘草苷、盐酸小檗碱、黄芩苷、连翘苷、大黄素、大黄酚峰面积的RSD分别为1.41%、2.80%、2.87%、2.11%、1.02%、1.45%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液（批号：Z21021460）适量，分别于室温下放置0、2、4、8、12 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，甘草苷、盐酸小檗碱、黄芩苷、连翘苷、大黄素、大黄酚峰面积的RSD分别为0.76%、1.56%、2.56%、2.09%、4.96%、5.68%（n＝5），表明供试品溶液室温放置12 h内基本稳定。

2.6 重复性试验

精密称取同一批样品（批号：Z21021460）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，共6份，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，甘草苷、盐酸小檗碱、黄芩苷、连翘苷、大黄素、大黄酚峰面积的RSD分别为1.51%、1.46%、6.44%、2.46%、1.54%、1.98%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.7 加样回收率试验

取已知含量样品（批号：Z21021460）适量，共6份，分别加入一定质量的待测成分对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表2。

表2 加样回收率试验结果（n＝6）Tab 2 Results of recovery tests（n＝6）

2.8 样品含量测定

取样品适量，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量。结果，样品中甘草苷、盐酸小檗碱、黄芩苷、连翘苷、大黄素、大黄酚含量平均值分别为1.161 4、0.220 3、0.467 2、0.194 0、0.162 2、1.136 0 mg/g（n＝3）。

3 讨论

3.1 检测波长的选择

通过紫外分光光度计对大黄酚、大黄素、甘草苷、连翘苷、黄芩苷和盐酸小檗碱进行测定，发现上述几种成分在280 nm波长处均有较好的紫外吸收，故采用280 nm作为检测波长。

3.2 流动相的选择

预试验中笔者分别选用甲醇-水（70∶30，V/V，等度洗脱）、甲醇-水（梯度洗脱）、甲醇-0.05%磷酸溶液（梯度洗脱）、乙腈-水（80∶20，V/V，等度洗脱）、甲醇-0.05%磷酸溶液（梯度洗脱）作流动相。结果显示，流动相为甲醇-0.05%磷酸溶液（梯度洗脱）时，色谱峰能够很好地分离，且峰形较好，可有效地缩短分析时间，满足分析要求。

综上所述，本方法操作简便，精密度、稳定性、重复性好，可用于牛黄宁宫片中6种成分含量的测定。

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（编辑：张 静）

Simultaneous Determination of 6 Components in Niuhuang Ninggong Tablets by HPLC

SUN Yantao1，2，SONG Yuhong1，2，ZHAO Lei3，YU Langtian4，WANG Liang1（1.College of Chemistry，Jilin Normal University，Jilin Siping 136000，China；2.Key Laboratory of Preparation and Application of Environmental Friendly Materials，Ministry of Education，Jilin Normal University，Jilin Siping 130103，China；3.Siping Institute for Food and Drug Control，Jilin Siping 136099，China；4.College of TCM，China Pharmaceutical University，Nanjing 211198，China）

R286；R927

A

1001-0408（2017）27-3862-03

2016-10-12

2016-12-08）

＊副教授。研究方向：光谱分析和色谱分析。E-mail：1979yanzi@163.com

#通信作者：教授。研究方向：分析化学。E-mail：16421800@qq.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.27.33