不同盐度下中华绒螯蟹胁迫相关基因的表达差异

彭智文, 黄 姝, 岳武成, 陈晓雯, 王 军, 王成辉,(1.上海海洋大学农业部淡水水产种质资源重点实验室;2.上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心;.上海海洋大学上海水产养殖工程技术研究中心,上海 20106)

不同盐度下中华绒螯蟹胁迫相关基因的表达差异

彭智文1,2, 黄 姝1,2, 岳武成3, 陈晓雯3, 王 军3, 王成辉1,2,3
(1.上海海洋大学农业部淡水水产种质资源重点实验室;2.上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心;3.上海海洋大学上海水产养殖工程技术研究中心,上海 201306)

通过对中华绒螯蟹在4个盐度梯度(0、10、20、30)下的胁迫试验，观察了4个类别的10个相关基因，即4个能量代谢相关基因、3个生长相关基因、2个应激性相关基因和1个渗透压调节相关基因的表达情况.结果表明：3个能量代谢相关基因(VATB、UBE、GAPDH)、1个应激性相关基因(GST)和渗透压调节相关基因(NAK)在不同盐度间的表达量存在显著差异(P<0.05)，而其他基因的表达量差异不显著(P>0.05).应用BestKeeper、NormFinder和GeNorm 3个软件对各基因的稳定性进行分析发现：应激性相关基因(GST)和渗透压调节相关基因(NAK)对盐度变化的响应程度较高，表达不稳定；3个生长相关基因(S27、β-ACTIN、α-TUB)对盐度变化的响应程度低，表达稳定，可以作为不同盐度处理下基因差异表达的内参基因.

中华绒螯蟹; 盐胁迫; 功能基因; 表达稳定性

Abstract: The expression profiles of 10 stress-related genes were investigated inEriocheirsinensisunder 4 salinity stress (0, 10, 20, 30). The targeted genes included 4 energy metabolism genes (vacuolarATPsynthasesubunitB,VATB;ubiquitin-conjugatingenzymeE2b,UBE;argininekinase,AK;glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH), 3 growth related genes (ubiquitin/ribosomalS27fusionprotein,S27;beta-actin,β-ACTIN;alpha-tubulin,α-TUB), 2 stress related genes (heatshockprotein90,HSP90;glutathioneS-transferase,GST), and one osmotic regulation gene (sodium-potassiumATPasealphasubunit,NAK). The results showed expression varied significantly among 3 energy metabolism related genes (VATB,UBE,GAPDH) , and stress related gene ofGSTand osmoregulation gene ofNAK) under different salinity stress (P<0.05), whereas no significant expression difference among the other genes(P>0.05). Referring to BestKeeper, NormFinder and GeNorm, expressions ofGSTandNAKwere sensitive and instable under different salinity stress, but expressions ofS27,β-ACTINandα-TUB) were highly stable, implying these 3 genes could be reference genes in expression analysis of Chinese mitten crab under salinity stress.

Keywords:Eriocheirsinensis; salinity stress; function gene; expression stability

中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)，俗称河蟹，是一种洄游性经济蟹类，其一生有两次洄游，即生长洄游(溯河洄游)和生殖洄游(降河洄游)[1].中华绒螯蟹在洄游过程中，由于外部环境的盐度变化引起其渗透压发生改变，会主动调节自身机体离子、渗透压和组织酶活性，从而适应体外生活环境，保证机体正常的生理代谢[2].探讨渗透压调节过程中相关基因的表达情况，对于了解渗透压调节的分子基础具有重要意义.国内外关于盐度对相关基因表达的影响已在其他蟹类进行了较多的研究.如马金武等[3]认为，Na+/H+-exchanger基因主要在三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)的鳃组织中特异性表达，在低盐中起作用，在高盐中的作用不明显.于坤等[4]研究表明，拟穴青蟹(Scyllaparamanmosain)的ANT2基因与能量代谢相关，在盐度为10时的表达量高于盐度35，低盐环境有助于青蟹代谢.王渝等[5]研究揭示了盐胁迫可显著改变三疣梭子蟹PtAQP基因在鳃和肝胰腺中的表达模式，整体呈先下降后上升最后下降到初始水平的表达趋势.覃烨等[6]研究表明，在高盐胁迫下三疣梭子蟹的HSP90a基因对大肠杆菌有保护作用，能显著提高大肠杆菌对盐胁迫的耐受力，HSP90a基因参与了三疣梭子蟹盐度适应的生理过程.Xu et al[7]认为，钠—钾ATP酶α亚基(sodium-potassium ATPase alpha subunit, NAK)基因和HSPs基因是三疣梭子蟹盐度驯化过程中重要的基因调控节点.相对而言，盐度变化对中华绒螯蟹相关基因表达情况的研究较为少见.如Li et al[8]对淡水和海水(盐度30)胁迫24 h后的鳃和肌肉的转录组进行分析，第一次报道了河蟹渗透压调节的差异表达基因和通路.茅海成等[9]研究表明，中华绒螯蟹在海水(盐度21)和淡水中饲养30 d后，海水环境下肌肉和肝胰腺中NAK基因的表达水平明显高于淡水环境，而该基因在鳃的表达水平却是淡水环境高于海水环境.然而，中华绒螯蟹的渗透压调节是一个复杂的过程，涉及多个不同功能类别的基因和通路.本试验通过对中华绒螯蟹在4个盐度梯度下的胁迫试验，观察了4个功能类别基因，即4个能量代谢基因[液泡ATP合成酶亚基B(vacuolar ATPsynthase subunit B, VATB)、泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzyme E2b, UBE)、精氨酸激酶(arginine kinase, AK)、甘油醛-3-磷酸脱氢(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)]，3个生长相关基因[泛素/核糖体S27融合蛋白(ubiquitin/ribosomal S27 fusionprotein, S27)、β-肌动蛋白(beta-actin, β-ACTIN)、α-微管蛋白(alpha-tubulin, α-TUB)]，2个应激性相关基因[热休克蛋白90(heat shock protein90, HSP90)、谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase, GST)]和1个渗透压调节相关基因NAK的表达变化及稳定性，探讨这些不同类别的功能基因对环境盐度变化的响应程度，旨在为了解中华绒螯蟹洄游过程中渗透压调节的分子基础提供一些有益资料；同时，该结果也可为中华绒螯蟹在不同盐度下基因表达分析提供较为可靠的内参基因.

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料来自上海海洋大学水产动物种质试验站的中华绒螯蟹良种选育系的幼蟹.取雌雄蟹各120只，共240只，规格为：雌蟹(6.54±1.43) g，雄蟹(7.38±1.67) g.用人工海水晶(广州市海荔水族科技有限公司)配置不同盐度梯度(0、10、20、30)的水体，暂养5 d后，分别放置于规格为62 cm×44 cm×35 cm的聚乙烯塑料箱中，每个塑料箱中放养雌雄蟹各10只，每个盐度梯度设置3个重复.每天定时定点投喂河蟹商业饲料(南通巴大饲料有限公司)，每3 d吸污一次并换水50%.根据幼蟹的蜕壳周期，饲养第10天进行取样，每个塑料箱各取5只雌雄蟹的后3对鳃，经液氮冷却后放入冰箱(-80 ℃)中保存.

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取与cDNA的合成 用Axygen-RNA提取试剂盒(美国 Axygen公司)提取鳃组织的总RNA，用1.2%的普通琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，使用NanoDrop ND-1000 SepCtrophotometer微量核酸测定仪(美国NanoDrop公司)检测其纯度和浓度.使用大连宝生物公司的反转录试剂盒(PrimeSciptTMRT regent Kit)进行cDNA的合成，具体操作按照产品说明书进行.

1.2.2 基因的选择与引物设计 从本实验室建立的河蟹鳃组织转录组数据库中选择4种类别功能的10个相关基因进行分析，包括4个能量代谢相关基因(VATB、UBE、AK、GAPDH)，3个生长相关基因(S27、β-ACTIN、α-TUB)，2个应激性相关基因(HSP90、GST)和1个渗透压调节基因 (NAK).运用Primer5.0软件进行引物设计，引物序列如表1所示.

1.2.3 实时荧光定量PCR扩增 使用CFX96实时荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)进行扩增，实时荧光定量PCR反应按照SYBR Green Premix Ex Taq试剂盒(日本TaKaRa公司)说明书要求操作.反应体系25 μL：12.5 μL SYBR Green Premix Ex Taq混合液、正反向引物各1 μL(10 μmol·L-1)、2 μL反应模板cDNA、8.5 μL ddH2O.PCR反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s ，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环.标准曲线由原模板cDNA稀释10倍扩增绘制出来.不同样本中的同一个基因都进行3次实时荧光定量PCR扩增.

表1 10个相关类别功能基因的PCR引物、扩增参数和效率Table 1 PCR primers, amplification parameters and efficiency of 10 genes

1.2.4 数据分析 使用CFX96实时荧光定量PCR仪上的自带软件CFX Manager 2.1对扩增结果进行数据分析，得到各样品的Ct值.用BestKeeper[10-11]、NormFinder[12]和GeNorm[13]3个软件进行各类别基因的稳定性分析.BestKeeper软件是根据各组样品基因的Ct值，对样品进行配对相关分析，计算出标准偏差(SD)、变异系数(CV)及各基因间的配对关系数(泊松相关系数)，再根据CV±SD来评估基因表达的稳定性， CV±SD越小，表明稳定性越高.NormFinde软件是结合组内方差与组间方差，计算出稳定值，稳定值小，表明表达稳定性好[14].GeNorm软件先计算出每个基因的稳定值，并对稳定值进行排序[15-19]，稳定值越小则表明基因表达越稳定.

2 结果与分析

2.1 基因引物的PCR扩增效率

实时荧光定量PCR反应产物经1.2%的普通琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明，10个相关基因的扩增长度与预期结果一致，熔解曲线均为明显的单一峰，相关系数(R2)≥0.995，扩增效率为95%～100%(表1).表明10个基因引物具有很好的扩增效率，能满足实时荧光定量PCR的扩增条件，可获得较好的特异性扩增.

2.2 基因的相对表达量

通过观察10个相关基因的Ct值(表2)，发现盐胁迫对不同类别基因的表达量有不同的影响.如在4个能量代谢的相关基因中，AK和UBE的表达量在不同盐度下存在极显著差异(P<0.01)，VATB的表达量差异显著(P<0.05)，而GAPDH的表达量无显著差异(P>0.05)；3个生长相关基因S27、β-ACTIN、α-TUB在不同盐度下的表达量无显著差异(P>0.05)；应激性相关基因GST在不同盐度下的表达量差异显著(P<0.05)，而HSP90的表达量不显著(P>0.05)；渗透压调节相关基因NAK在不同盐度下的表达量差异显著(P<0.05).

2.3 基因表达的稳定性

综合运用BestKeeper、NormFinder、GeNorm 3个软件分析10个相关基因在不同盐度下的表达稳定性(表3).BestKeeper软件分析结果表明，生长相关基因S27对盐度变化不敏感，最为稳定，其次为生长相关基因α-TUB，而应激性相关基因GST和渗透压调节相关基因NAK对盐度变化的响应程度较高，较不稳定.NormFinder和GeNorm 软件分析结果均表明，生长相关基因α-TUB在不同盐度下的表达最为稳定，应激性相关基因GST和渗透压调节相关基因NAK的表达最不稳定.

表2 10个相关基因在不同盐度下的Ct值1)Table 2 Ct values of 10 genes under different salinity conditions

1)数据为M±SD；同行数据后附不同字母者表示差异显著(P<0.05)，附相同字母者表示差异不显著(P>0.05).

表3 应用3个软件分析10个相关基因在不同盐度下的表达稳定值Table 3 Expression stability values of 10 genes under different salinity conditions by 3 softwares

3 讨论

盐度作为一种与渗透压密切相关的环境因子，盐度变化会导致虾蟹类耗氧率升高、对能量的需求增加、代谢加速等生理变化[20].盐度变化后虾蟹需要进行渗透调节达到一个新的渗透平衡状态，而渗透压调节是一个复杂的过程，需要一系列的功能基因参与其中.本试验中，HSP90基因在盐度为10～30时是高度表达的.Zhang et al[21]研究表明，在盐胁迫下，三疣梭子蟹鳃组织的HSP90和HSP60基因的表达量显著上升，用以作为维持机体稳态的一种手段；Xu et al[7]研究也证明了这一结果.研究还表明，当机体受到盐胁迫时，HSP90基因可以识别变性蛋白的疏水区域，协助变性蛋白或折叠蛋白重新恢复天然构象，阻止蛋白颗粒发生不可逆的聚集、沉淀，从而提高细胞的胁迫耐受性[22].本试验发现另一应激性相关基因GST在盐度为0～10时的表达量存在显著差异(P<0.05)，这与Lee[23]对岸蟹(Carcinusmaenas)在盐胁迫下的研究结果相类似.本试验结果表明，应激性相关基因对盐胁迫较为敏感，对盐度变化的响应程度较高.

在水体环境盐度突变的情况下，甲壳类的NAK基因活力发生了明显变化[24]，水生甲壳动物对外界盐度变化的适应，主要通过渗透压来实现，该过程主要通过鳃上皮的NAK基因来起作用.如Hurtado et al[25]对凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)的研究表明，在盐胁迫下，凡纳滨对虾NAK基因的表达量存在显著差异，整体趋势为先上升后下降，最后趋于稳定；亓磊等[26]对拟穴青蟹(Scyllaparamamosai)的研究结果也表明，在不同盐度下，NAK基因表达量是不同的.NAK基因催化ATP水解为ADP时释放出的能量，将细胞内的钠离子转运到细胞外，同时将细胞外的钾离子转运到细胞内，以维持细胞内外离子浓度的相对平衡[27].本试验结果显示，盐度为10时，NAK基因的表达量最高，表明刚在盐度刺激下，NAK基因活力显著上升，随后活力逐渐下降，最终趋于平稳，表明NAK基因对低盐度的响应程度较高.本试验还发现，生长相关的基因(S27、β-ACTIN、α-TUB)在不同盐度下的表达没有显著差异，对盐度的响应程度很低，且与盐度的相关性较差.再综合3个基因稳定性软件分析的结果得出，应激性相关基因(GST)和渗透压调节相关基因(NAK)对盐度变化的响应程度较高，表达不稳定；3个生长相关基因(S27、β-ACTIN、α-TUB)对盐度变化的响应程度低，表达稳定，可以作为不同盐度下基因差异表达的内参基因.

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(责任编辑:施晓棠)

Effectofdifferentsalinityontheexpressionprofilesofstress-relativegenesinChinesemittencrab,Eriocheirsinensis

PENG Zhiwen1,2, HUANG Shu1,2, YUE Wucheng3, CHEN Xiaowen3, WANG Jun3, WANG Chenghui1,2,3
(1.Key Laboratory of Freshwater Aquatic Genetic Resources, Ministry of Agriculture; 2.National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education; 3.Shanghai Engineering Research Center of Aquaculture, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China)

S917

A

1671-5470(2017)05-0552-05

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.05.012

2017-02-28

2017-06-05

上海市科委崇明科技专项项目(13391912102)；上海市工程技术中心建设项目(13DZ2251800).

彭智文(1991-),男,硕士研究生.研究方向：水产动物种质资源.Email:584736116@qq.com.通讯作者王成辉(1972-),男,教授.研究方向：水产动物种质资源.Email:wangch@shou.edu.cn.