茵芋花粉培养效应的优化

阮淑明, 郑天汉, 华伟平, 吴远彬, 兰思仁(.福建林业职业技术学院林学系，福建 南平 000；.福建省林业厅世行办，福建 福州 000；.武夷学院林学系，福建 武夷山 00；.福建林业勘察设计院，福建 福州 000；.福建农林大学园林学院，福州 福建 000)

茵芋花粉培养效应的优化

阮淑明1, 郑天汉2, 华伟平3, 吴远彬4, 兰思仁5
(1.福建林业职业技术学院林学系，福建 南平 353000；2.福建省林业厅世行办，福建 福州 350003；3.武夷学院林学系，福建 武夷山 354300；4.福建林业勘察设计院，福建 福州 350001；5.福建农林大学园林学院，福州 福建 350002)

为研究茵芋花粉的培养效应，采用蔗糖、硼酸、氯化钙三因素三水平培养基离体培养法， I2—KI、TTC、红墨水等染色法，以及生物荧光显微镜对花粉活力进行观察与检测，筛选有活力的花粉的最适培养基及活力测定方法.结果表明，新鲜茵芋花粉粒呈黄色，花粉离体后逐渐转变为黄褐色.I2—KI、TTC对花粉染色无效;红墨水染色法使有活力的花粉在蓝色滤光片下呈绿色或原色，能够快速有效地检测花粉活力.花粉于25 ℃的恒温下离体培养4 h开始萌发，至24 h萌发稳定.蔗糖、硼酸、氯化钙三因素三水平培养基离体培养对花粉萌发的互作效应极显著，最优培养基为：15 g·L-1蔗糖+0.05 g·L-1硼酸+0.02 g·L-1氯化钙，萌发率为60.0%；次优培养基为：15 g·L-1蔗糖+0.03 g·L-1硼酸+0.02 g·L-1氯化钙，萌发率为58.0%；第三培养基为：15 g·L-1蔗糖+0.01 g·L-1硼酸+0.01 g·L-1氯化钙，萌发率为50.4%.影响茵芋花粉萌发的主因素为氯化钙，次因素为蔗糖，辅助因素为硼酸.

茵芋; 花粉活力; 染色法; 离体培养

Abstract: In order to screen out the optimal medium forinvitropollen germination ofSkimmiareevesianaand reliable pollen vitality evaluation method, an orthogonal design with 3 factors in 3 levels, including sucrose, boric acid and calcium chloride, were implemented. Pollen vitality was evaluated by methods of I2—KI, TTC, red staining, and bioluminescent display. The results showed that freshS.reevesianapollen was yellow and turned yellowish browninvitro. I2—KI and TTC methods were inapplicable to vitality test. However, by red ink staining, vitalS.reevesianapollen was green or in the original color under blue optical filter, indicating that it is an effective method for pollen vitality test. Pollen began to germinate 4 h afterinvitroculture at 25 ℃ and reached stable status within 24 h. The interactive effect of 3 chemicals oninvitropollen germination was significant. The optimal medium formula was 15 g·L-1sucrose, 0.05 g·L-1boric acid, and 0.02 g·L-1calcium chloride, reaching a 60.0% germination rate. Among all factors that affecting germination rate, calcium chloride was the predominate factor, which was followed by sucrose and boric acid.

Keywords:Skimmiareevesiana; pollen vitality; staining method; cultureinvitro

茵芋(Skimmiareevesiana)属芸香科茵芋属，又名黄山桂，为常绿灌木，花单性[1].茵芋为观叶、观花、观果俱佳的植物，是我国传统的药用植物，主治风湿痹痛、四肢挛急、两足软弱.多脉茵芋可分离出生物碱、花青素衍生物、香豆素衍生物、萜类化合物、脂肪酸，以及挥发性化合物甲基多脉茵芋醇、蒲公英萜酮、吴茱萸素、香草木宁、拟芸香品、新植二烯、月桂酸甲醋等[2].茵芋原生种质资源稀少，为雌雄异株植物，蜂媒、风媒授粉.原生地处于海拔1 400～2 400 m的地带，湿度大、多云雾、高紫外线辐射、气温变幅大[2-4]，此环境下的蜜蜂已难以生存，因此，茵芋主要以风媒进行自然授粉.茵芋人工栽培中常见花期不一致的问题，严重影响茵芋的授粉、结实，人工辅助授粉是茵芋驯化栽培的重要环节.因此，在人工授粉之前需要快速、可靠地测定茵芋花粉的生活力，评估花粉是否有授精能力，以保证人工授粉的效果.目前，国内外尚未见关于茵芋花粉活力测定的相关报道.

1 材料与方法

1.1 材料

供试茵芋花粉取自福建省洋口国有林场培育的3年生盘栽雄株.选取3株生长健壮、无病虫害的植株进行采粉，植株平均株高28 cm，平均冠幅23 cm.

1.2 方法

表1 茵芋花粉离体培养基的配制Table 1 Formula for in vitro culture medium of S.reevesiana pollen

1.2.1 试验设计 在2015年预试验的基础上，2016年再次采用I2—KI染色法、氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyl-tetrazolium chloride, TTC)染色法、红墨水染色法，以及蔗糖、硼酸、氯化钙三因素三水平培养基进行花粉萌发的离体培养试验，设计方案见表1.

1.2.2 花粉的提取 花粉于2016年3月22日,即茵芋盛花期采集.选取花药饱满刚开裂但未散粉或即将开裂散粉的花药，用镊子夹起花药，解剖针刺破花粉囊抖落散出花粉，将花粉集中收集于载玻片上备用.

1.2.3 花粉染色检测 采用I2—KI、TTC、红墨水染色法检测[5-8].I2—KI染色法使正常花粉变蓝，而不具有活力的花粉呈黄褐色；TTC染色法使具有活力的花粉呈红色，而无活力的花粉则不变色或变色不明显[9-10]；红墨水染色法使红墨水中的酸性大红C不能进入有活力的细胞内而不被染色，丧失活力的细胞使酸性大红C进入细胞而被染色[11].

按每处理3次重复将采集的花粉移至1 mL Ep管中，分别加入I2—KI、含量为0.5%的TTC、含量为5%的普通红墨水几滴，充分振荡均匀，染色20 min后，用吸管吸取适量的花粉悬浊液于载玻片上，盖上盖玻片并编写顺序号.

1.2.4 花粉的离体培养 根据表1的方案配制27个组合的培养基，分别放入花粉并用解剖针搅拌均匀，培养基中加入0.7%琼脂，pH为5.8～6.0，置于载玻片上转入25 ℃恒温的暗条件下进行花粉萌发培养[7-8]，每4 h检测一次，连续检测24 h.

1.2.5 花粉活力的显微检测 光学显微镜下每处理随机选取5个视窗观察并拍照花粉着色情况，每个视窗花粉总数要大于30粒，计算有活力的花粉百分率.花粉离体培养中，将载有花粉的载玻片置于IBE2000型倒置生物荧光显微镜下观测，花粉管长度超过花粉粒直径即为花粉萌发，并在光学显微镜下用测微尺测量花粉管长度，统计分析各处理的花粉萌发率、花粉管长度.

1.2.6 数据分析 试验数据采用EXCEL、SPSS软件进行统计分析.染色率/%=被染色的花粉粒数/视野中的花粉粒总数×100；萌发率/%=萌发的花粉粒数/视野中的花粉粒总数×100.

2 结果与分析

2.1 茵芋花粉形态与花粉管发育过程

IBE2000型倒置生物荧光显微镜观察显示，茵芋花粉均为单粒花粉，辐射对称，似毛线缠绕球状(图1A)，赤道面观呈圆形或椭圆形，极面观呈圆形.新鲜茵芋花粉粒肉眼下呈黄色(图1B)，花粉离体后随着时间的延长逐渐转为黄褐色，在室内气温约16 ℃下放置24 h后，花粉粒外壁物质自然脱落(图1C)，从而影响花粉活力.在光学显微镜下测得花粉平均直径为35.53 μm，生长稳定后的花粉管平均长度为253.1 μm.花粉离体培养4 h时，则有个别花粉开始萌发(图1D).刚萌发的花粉管粗且直，而后逐渐伸长生长，24 h后花粉管基本停止生长，花粉管长度可达花粉粒直径的数倍(图1E)，且花粉管生长具有明显趋向培养基营养液的效应.

A：花粉的显微结构(2 500倍)；B：新鲜花粉的显微色泽(100倍);C：室温放置1 d，花粉外壁物质脱落;D：花粉离体培养4 h开始萌发;E:离体培养24 h的花粉管形态;F:红墨水染色后的花粉颜色.图1 茵芋花粉形态与萌发过程Fig.1 Pollen morphology and germination of S.reevesiana

2.2 茵芋花粉活力的染色效应

茵芋花粉经红墨水染色20 min后，花粉粒着色成功且已基本稳定，红墨水染色法使有活力的花粉在蓝色滤光片下呈绿色或原色(图1F)，无活力的花粉呈红色，由此测得花粉活力的平均值为68.2%；而花粉经I2—KI、TTC染色20 min至48 h均未染色.试验中染色、离体培养法所采用的花粉为“同质、同时、同批”，离体培养法却测得较高的花粉萌发率，表明花粉在I2—KI、TTC下未被染色，不能以此说明其没有活力，而是由花粉的自身特性(如花粉壁厚度、外壁组成物质、淀粉含量、花粉粒内部酶类型及其活性等)造成的.因此，I2—KI和TTC染色法不适合于茵芋花粉活力的测定.

2.3 茵芋花粉离体培养的效应

2.3.1 不同培养基对花粉萌发的影响效应 茵芋花粉在蔗糖(A)、硼酸(B)、氯化钙(C)3种含量中的总平均萌发率为38.8%.其中，A1、A2、A3的平均萌发率分别为33.3%、41.1%、41.9%，B1、B2、B3的平均萌发率分别为34.4%、40.8%、41.2%，C1、C2、C3的平均萌发率分别为38.4%、45.6%、32.4%.

方差分析结果(表2)表明，A、B、C对茵芋花粉萌发的影响均达极显著水平，即A、B、C单因素条件下的不同含量对花粉萌发的影响极显著.

表2 茵芋花粉萌发率多因素互作效应的方差分析1)Table 2 Variance analysis of multiple factors of interactive effect on pollen germination rate of S.reevesiana

1)*、**分别表示显著、极显著差异.

3种蔗糖含量对茵芋花粉萌发率的效应表现为：A3>A2>A1，即花粉萌发率随着蔗糖含量的增大而增高.A3、A2的萌发率较A1的萌发率分别比增20.5%、19.0%，A3的萌发率较A2的萌发率仅比增1.9%，表明5 g·L-1的蔗糖含量偏低，10、15 g·L-1的蔗糖含量较合适.

3种硼酸含量对茵芋花粉萌发率的效应表现为：B3>B2>B1，即花粉萌发率随着硼酸含量的增大而增高.B3、B2的萌发率较B1的萌发率分别比增16.5%、15.7%，B3的萌发率较B2的萌发率仅比增1.0%，表明0.01 g·L-1的硼酸含量偏低，0.03、0.05 g·L-1的硼酸含量较合适.

3种氯化钙含量对茵芋花粉萌发率的效应表现为：C2>C1>C3，C2、C1的萌发率较C3的萌发率分别比增28.9%、15.6%，C2的萌发率较C1的萌发率仅比增15.8%，即0.02 g·L-1氯化钙促进花粉萌发的作用最好，0.01 g·L-1氯化钙次之，0.03 g·L-1氯化钙则抑制了花粉萌发.

2.3.2 不同成分与含量对花粉萌发的互作效应 由图2可见，蔗糖、硼酸、氯化钙三因素三水平构成的27种培养基对茵芋花粉萌发率的影响从大到小依次为A3B3C2(60.0%)、A3B2C2(58.0%)、A3B1C2(50.4%)、A2B3C2(48.5%)、A1B3C1(48.2%)、A2B2C2(47.7%)、A1B2C1(44.0%)、A2B2C3(44.0%)、A3B3C3(43.0%)、A2B3C1(42.9%)、A2B2C1(41.4%)、A2B1C2(39.2%)、A1B2C2(38.1%)、A3B2C3(38.0%)、A1B1C1(37.2%)、A1B3C2(36.0%)、A2B3C3(36.0%)、A2B1C1(35.7%)、A2B1C3(35.0%)、A3B2C1(34.1%)、A1B1C2(32.4%)、A3B3C1(31.9%)、A3B1C3(31.0%)、A3B1C1(30.1%)、A1B3C3(24.0%)、A1B2C3(22.0%)、A1B1C3(18.0%).A×B×C构成的27种培养基中，A3B3C2最优，最优培养基的花粉萌发率是最差培养基的3.3倍，表明蔗糖、硼酸、氯化钙及其含量对茵芋花粉萌发的互作效应明显.

图2 A×C×B互作效应的花粉萌发率Fig.2 Pollen germination rate by interactive effect of A×C×B

由表2可见，A×B×C的互作效应对茵芋花粉萌发率的影响达显著水平.但除了A×C的互作效应极显著外，A×B、B×C的互作效应不明显.为进一步分析各因素及其含量水平的互作效应来源，分别对蔗糖、硼酸、氯化钙三因素三水平的培养基进行分组分析.

图3 A×B互作效应的花粉萌发率Fig.3 Pollen germination rate by interactive effect of A×B

由图3可见，A×B构成的9种培养基中的茵芋花粉萌发率分别为29.3%(A1B1)、34.5%(A1B2)、36.2%(A1B3)、36.5%(A2B1)、44.5%(A2B2)、42.5%(A2B3)、37.3%(A3B1)、43.4%(A3B2)、45.0%(A3B3).虽然9种培养基的互作效应未达到显著水平，但除了A2B3以外，其他培养基都表现为萌发率随着硼酸含量的增大而增高；除了A1B1以外，其他培养基的萌发率都大于A1单因素的平均萌发率33.3%，表明A×B仍然具有一定的促进效应，且随着含量的增大呈叠加效应.

由图4可见，A×C构成9种培养基中的茵芋花粉萌发率分别为43.2%(A1C1)、41.5%(A1C2)、39.6%(A1C3)、40.0%(A2C1)、41.2%(A2C2)、43.3%(A2C3)、32.0%(A3C1)、38.8%(A3C2)、46.8%(A3C3).A×C的9种培养基中，除了A3C1以外，其他培养基的萌发率都大于C因素的平均萌发率38.8%，表明A×C也具有互作效应；除了A3C1以外，其他培养基的萌发率基本一致，表明蔗糖与氯化钙构成的培养基对花粉萌发具有较一致的促进作用；A×C互作效应极显著，差异主要来源于A3C1、A3C3；另外，较高的蔗糖含量需要较高的氯化钙含量相配合.

由图5可见，B×C构成9种培养基中的茵芋花粉萌发率分别为34.3%(B1C1)、39.8%(B1C2)、41.0%(B1C3)、39.8%(B2C1)、41.0%(B2C2)、40.7%(B2C3)、41.0%(B3C1)、40.7%(B3C2)、47.9%(B3C3).B×C的9种培养基中，除了B3C3以外，其他培养基的萌发率基本一致，表明硼酸与氯化钙构成的培养基对花粉萌发的促进作用不理想，B3C3处理可能是由较高的氯化钙含量引起.

图4 A×C互作效应的花粉萌发率Fig.4 Pollen germination rate by interactive effect of A×C

3 讨论

本试验结果表明：I2—KI、TTC对茵芋花粉活力染色检测没有效果，有活力、无活力的花粉均未被染色；红墨水染色法使有活力的花粉在蓝色滤光片下呈绿色或原色，且20 min后基本稳定，无活力的花粉呈红色，表明红墨水染色法能够快速有效地检测花粉活力.茵芋花粉离体培养4 h则有零星花粉开始萌发，至24 h花粉萌发基本稳定，可以确定为茵芋花粉萌发的终止期限.虽然，红墨水染色法可以直接检测茵芋花粉的活力水平，蔗糖、硼酸、氯化钙等外部介质作用下的离体培养法可以直接检测花粉的萌发率，但染色法的检测结果与离体培养法的检测结果有显著差异，红墨水染色法检测的花粉活力为68.2%，离体培养的平均萌发率为38.8%，二者差异表明离体培养结果对茵芋人工授粉更具指导意义.在众多植物花粉活力的测定中也发现[6]，染色法测定的数值明显高于离体萌发法，但花粉活力的变化趋势基本一致.可见，染色法常常将部分无活力的花粉染色误计入有活力的一类，从而增大了观察值及试验误差，综合分析认为离体培养法的花粉萌发率更准确可靠.胡春等[12]、李畅等[13]、赵统利等[14]分别对钝裂银莲花、一品红、百合的花粉进行活力检测，发现离体萌发法测定的花粉活力最接近真实值，离体萌发法在生产上更具指导意义.另外，本试验对茵芋花粉采用I2—KI、TTC、红墨水染色法及离体培养法的检测结果表明，红墨水染色法与离体培养法相比较，其方法更简便、取材更容易、检测更快速，在生产实践中可行且有效，对于花粉萌发率与活力检测之间的误差，可以根据红墨水染色法、离体培养法两种检测结果，借助生物学原理和数理统计理论计算出修正参数.此外，I2—KI、TTC对许多植物花粉活力染色检测的效果显著，但对茵芋花粉活力的检测却无效，表明采用多种方法检测从而筛选出最适用于茵芋花粉活力的检测方法具有重要意义.

本试验结果表明，蔗糖、硼酸、氯化钙及其不同含量对茵芋花粉萌发率具有明显效应.蔗糖、硼酸、氯化钙不同含量之间的萌发率差异明显，蔗糖、硼酸、氯化钙的最适含量分别为15、0.05、0.02 g·L-1.蔗糖、硼酸、氯化钙及其不同含量对茵芋花粉萌发率的互作效应显著，最优培养基A3B3C2的萌发率为60.0%，次优培养基A3B2C2的萌发率为58.0%，A3B1C2的萌发率也较优，达50.4%；最优培养基A3B3C2的花粉萌发率是最差培养基A1B3C3的3.3倍，A3B3C2的花粉萌发率是单因素培养基最优萌发率(C2)的1.32倍，是双因素培养基最优萌发率(B3C3)的1.25倍，表明蔗糖、硼酸、氯化钙及其含量构成的培养基对茵芋花粉萌发的互作效应最突出.双因素互作效应显示，蔗糖与氯化钙构成的培养基对茵芋花粉萌发率的互作效应极显著，蔗糖与硼酸、硼酸与氯化钙的互作效应不显著.综合分析外部介质对茵芋花粉萌发率影响的主次作用，具体表现为：氯化钙发挥主因素作用，蔗糖发挥次因素作用，硼酸发挥辅助作用.

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(责任编辑:施晓棠)

InvitropollenculturemediumoptimizationandvitalitytestforSkimmiareevesiana

RUAN Shuming1, ZHENG Tianhan2, HUA Weiping3, WU Yuanbin4, LAN Siren5

(1.Department of Forestry， Fujian Forestry Vocational Technical College, Nanping, Fujian 353000, China; 2.World Bank Loan Afforestation Office， Fujian Provincial Department of Forestry, Fuzhou, Fujian 350003, China; 3.Department of Forestry，Wuyi University, Wuyishan, Fujian 354300, China; 4.Fujian Provincial Forestry Survey and Design Institute, Fuzhou, Fujian 350001, China; 5.College of Landscape Architectur， Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China)

S567.1+9

A

1671-5470(2017)05-0515-06

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.05.006

2017-02-14

2017-05-02

福建省科技项目(闽林科[2014]2号、闽林计财[2014]97号)；福建林业职业技术学院院士专家工作站项目(2015YSZ002).

阮淑明(1972-)，女，副教授.研究方向：植物生理.Email:2380818851@qq.com.通讯作者兰思仁(1963-)，男，教授，博士生导师.研究方向：森林景观.Email:lsr9636@163.com.