火针对脊髓损伤大鼠神经干细胞 Wnt/β-catenin通路基因表达的离体研究

徐家淳,赵志恒,程素利,王雪,焦召华,蔡志敏,李婷,时旭平,周震,刘保红,李岩

(1.天津中医药大学,天津 300193;2.天津市公安医院,天津 300042;3.河北科技师范学院,秦皇岛 066000;4.天津中医药大学第二附属医院,天津 300150)

火针对脊髓损伤大鼠神经干细胞 Wnt/β-catenin通路基因表达的离体研究

徐家淳1,赵志恒1,程素利1,王雪1,焦召华2,蔡志敏3,李婷1,时旭平1,周震4,刘保红2,李岩2

(1.天津中医药大学,天津 300193;2.天津市公安医院,天津 300042;3.河北科技师范学院,秦皇岛 066000;4.天津中医药大学第二附属医院,天津 300150)

目的 观察火针对脊髓损伤Wnt/β-catenin通路上神经干细胞Wnt、β-catenin基因的调控作用。方法 将60只SD雌性大鼠随机分为空白组5只、假手术组5只、模型组25只、火针组25只,模型组和火针组大鼠又分为1 d组、3 d组、7 d组、10 d组和14 d组;采用改良的Allen's法对模型组和火针组造模,观察各组BBB评分,Wnt3a和β-catenin基因表达变化。结果 在7 d、10 d时模型组和火针组BBB评分明显高于同组前一时相,差异具有统计学意义(P＜0.05);火针组大鼠在治疗后各时间点BBB评分明显高于模型组,差异具有统计学意义(P＜0.05)。在7 d、10 d时模型组和火针组Wnt3a基因表达量较同组前一时相均增加(P＜0.05);在7 d、10 d时火针组Wnt3a基因表达量高于模型组,差异具有统计学意义(P＜0.05);β-catenin基因表达水平变化趋势与Wnt3a基本一致。结论 火针可调控脊髓损伤神经干细胞Wnt3a、β-catenin基因表达。

针刺疗法;火针;脊髓损伤;Wnt3a基因;β-catenin基因;大鼠

脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是一种严重的神经系统疾病,可引起直接性机械损伤和继发性损伤级联反应,往往导致永久性损伤[1]。SCI后星形胶质细胞、小神经胶质细胞和少突胶质细胞的反应性增生阻碍了脊髓再生,因此 SCI后促进神经元再生是早期治疗SCI的关键。而适当诱导神经干细胞(neural stem cells,NSCs)增殖并向神经元分化是减轻 SCI病理性损伤、促进其神经再生与修复的一种潜在治疗方法[2-3]。NSCs向神经元的分化受多种因素影响和制约,并由多条信号转导通路所介导,其中 Wnt/β-catenin信号途径是一条经典的信号途径。该信号途径对NSCs的增殖和分化有着重要的作用,给目前 SCI的治疗带来了希望[4-5]。如果可刺激该信号在SCI后高表达,促使NSCs向神经元分化,对恢复脊髓功能意义重大。本研究拟建立 SCI大鼠模型,在离体状态下观察火针对不同时点SCI大鼠Wnt/β-catenin通路基因表达的影响,为揭示火针治疗SCI的机理提供部分实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

健康SPF级孕14 d SD大鼠2只。2月龄雌性SD大鼠60只,体重260 g左右;由中国食品药品检定研究所提供[许可证号 SCXK(京)2009-0017],采用随机数字表法随机分为空白组5只、假手术组5只、模型组25只、火针组25只;模型组和火针组又分别分为1 d组、3 d组、7 d组、10 d组、14 d组各5只。

1.2 模型制备及行为学评分

采用本课题组改良的 Allen's法[6]对模型组和火针组大鼠建立 SCI模型,假手术组大鼠仅切除 T9、T10椎板,术后小心护理饲养,每天挤压排尿3次。造模前及各时间点对各组大鼠进行BBB运动评分[7]。

1.3 干预方法

造模成功后即对火针组SCI大鼠采用速刺法进行火针针刺,针刺T7,T8及T11,T12棘突间隙旁的华佗夹脊穴;之后每隔24 h治疗1次。

1.4 观察指标

1.4.1 行为学评分

造模前及各时间点对各组大鼠进行BBB评分[7]。

1.4.2 血清制备

空白组和假手术组大鼠在24 h后,模型组和火针组大鼠于相应时间点(1 d,3 d,7 d,10 d,14 d)麻醉后于无菌条件下腹主动脉采血,分离血清。56℃灭活30 min,220 nm滤膜滤过除菌,-20℃保存备用。

1.4.3 神经干细胞培养与鉴定

无菌条件下取SD胎鼠,D-Hanks液充分漂洗后,在解剖显微镜下剥离皮肤、肌肉等组织,用眼科剪剪碎脊髓后,0.25%胰蛋白酶消化,吸管吹打,200目铜网过滤,离心,弃上清,再转移到 DMEM/F12(1:1)加 B27和bFGF(20 ng/mL)的无血清培养基,以细胞浓度为5×105个/mL接种入 24孔培养板中培养,每孔加入细胞悬液500 μL。置入37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中培养。此后每3 d半量换液1次,每7 d机械分离克隆传代1次,方法同前。传代培养纯化的细胞经Nestin鉴定,显示 Nestin免疫反应阳性,表明所培养的细胞为神经干细胞。

1.4.4 火针对神经干细胞Wnt3a及β-catenin基因表达水平影响的检测

离心收集传代培养 3代的 NSCs,将细胞接种于 6孔培养板,接种密度为 2×105个/mL。将 NSCs按培养基中所含血清成分的不同共分空白组、假手术组、模型组及火针组,其中模型组和火针组根据时间点不同分为1 d组、3 d组、7 d组、10 d组、14 d组,共12种血清。各组培养基均为含10%浓度SD大鼠不同血清成分的 DMEM/F12基础培养基(不含 B27、rhEGF和rhbFGF),每3孔为同一血清成分培养液。不同血清成分干预神经干细胞后培养72 h,采用RT-PCR法检测各组细胞中 Wnt通路中 Wnt3a及β-catenin目的基因mRNA表达量的变化。

1.5 统计学方法

采用SPSS19.0软件对数据进行统计学处理,计量资料服从正态分布以均数±标准差表示,不服从以[中位数,(四分位间距)]表示,方差齐,两组比较采用独立样本t检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠BBB评分比较

各时间点评分显示模型组和火针组大鼠BBB评分逐渐升高,其中模型组在7 d、10 d和14 d时评分明显高于前一时相,差异具有统计学意义(P＜0.05);火针组在7 d和10 d时评分明显高于前一时相,差异具有统计学意义(P＜0.05);而火针组大鼠在治疗后各时间点评分明显高于模型组,差异均具有统计学意义(P＜0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠BBB评分情况 [M,(Q)/±s,分]

表1 各组大鼠BBB评分情况 [M,(Q)/±s,分]

注:与模型组比较1)P＜0.05;与同组前一时相比较2)P＜0.05

组别n造模前 1 d 3 d 7 d 10 d 14 d空白组 5 21.00,(0.00) 21.00,(0.00) - - - -假手术组 5 21.00,(0.00) 21.00,(0.00) - - - -模型组 5 21.00,(0.00) 0.00,(0.00) 1.40±0.55 4.80±0.842)6.00±0.712)7.6±0.552)火针组 5 21.00,(0.00) 0.00,(0.00) 2.40±0.891)7.40±0.551)2)8.80±0.841)2)9.4±0.551)

2.2 火针对神经干细胞Wnt3a及β-catenin基因表达水平的影响

不同干预条件处理神经干细胞72 h后,与假手术组比较,1 d时模型组和火针组Wnt3a基因表达量明显降低,差异具有统计学意义(P＜0.05),且降低的趋势持续到3 d;在7 d、10 d时模型组和火针组Wnt3a基因表达量均增加,较前一时间点差异均有统计学意义(P＜0.05);在7 d、10 d时火针组Wnt3a基因表达量均比高于模型组,差异具有统计学意义(P＜0.05)。详见表 2。β-catenin基因表达水平变化趋势与 Wnt3a基本一致。详见表3。

表2 各组大鼠不同时相Wnt3a基因表达 (±s)

表2 各组大鼠不同时相Wnt3a基因表达 (±s)

注:与假手术组比较1)P＜0.05;与模型组比较2)P＜0.05;与同组前一时相比较3)P＜0.05

组别n1 d 3 d 7 d 10 d 14 d空白组 3 1.10±0.26 - - - -假手术组 3 1.00±0.00 - - - -模型组 3 0.63±0.041)0.41±0.03 1.12±0.153)1.42±0.133)1.34±0.08火针组 3 0.56±0.121)0.43±0.04 1.50±0.032)3)1.80±0.142)3)1.45±0.133)

表3 各组大鼠不同时间点β-catenin基因表达 (±s)

表3 各组大鼠不同时间点β-catenin基因表达 (±s)

注:与假手术组比较1)P＜0.05;与模型组比较2)P＜0.05;与同组前一时相比较3)P＜0.05

组别n1 d 3 d 7 d 10 d 14 d空白组 3 0.95±0.1 - - - -假手术组 3 1.00±0.0 - - - -模型组 3 0.32±0.031)0.21±0.03 0.53±0.143)0.83±0.133)1.12±0.133)火针组 3 0.37±0.121)0.29±0.06 1.05±0.052)3)1.42±0.162)3)1.26±0.24

3 讨论

SCI后不仅降低了患者的生活质量,而且带来了沉重的经济负担,且随着经济水平的高速发展、交通事故增多等原因,SCI发生率逐年增高。然而SCI后出现的组织水肿、变性、坏死、神经细胞凋亡阻碍了脊髓神经功能的修复,因此研究探索行之有效的治疗方法刻不容缓。近年来研究发现,内源性神经干细胞直接参与了神经系统损伤的自然修复过程,SCI后神经干细胞的激活、增殖、分化成为SCI后神经功能恢复的关键。

Wnt信号通路是一类广泛存在于多细胞真核生物中高度保守的复杂的信号通路,在神经干细胞的增殖、分化中发挥重要作用[8],其中 Wnt/β-catenin信号通路是最经典的一条通路,在神经干细胞的增殖分化和轴突导向中具有关键作用[9]。Wnt3a不仅在发育中的脊髓神经祖细胞具有促有丝分裂效应[10],还可在脊髓背侧神经元的特化中发挥重要作用[11],增加 SCI后的神经元数量,促进轴突传导及神经功能的改善[12]。现有研究显示针灸具有调控 Wnt/β-catenin信号通路的作用[13-14],但研究多集中于骨质疏松症、脑梗死等,而无与SCI的相关研究。

火针为传统针灸疗法的一种,不仅可促进 SCI模型大鼠神经干细胞增殖[15],而且具有抑制神经细胞凋亡作用[16]。本次研究采用RT-PCR法离体研究了火针对SCI后Wnt/β-catenin信号通路中关键因子Wnt3a和β-catenin基因表达的影响,研究发现SCI后Wnt3a和β-catenin的基因表达量均显著降低,而在7 d后呈现高表达,这种变化可能有助于 NSCs向神经细胞分化;而经火针疗法干预后的Wnt3a和β-catenin的基因表达量在7 d和10 d时均明显高于模型组,表明火针疗法具有调控Wnt3a和β-catenin基因表达的作用,揭示了火针治疗SCI的部分机制。基于此,笔者推测火针可通过调控Wnt通路促进神经干细胞增殖分化达到修复SCI的目的,本课题组将会进一步对此进行研究探索,为火针治疗SCI提供实验依据。

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In Vitro Study on Fire Needling and the Expression of Wnt/β-catenin Pathway Genes in Neural Stem Cells in Rats with Spinal Cord Injury

XU Jia-chun1,ZHAO Zhi-heng1,CHENG Su-li1,WANG Xue1,JIAO Zhao-hua2,CAI Zhi-min3,LI Ting1,SHI Xu-ping1,ZHOU Zhen4,LIU Bao-hong2,LI Yan2. 1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin300193,China; 2.Tianjin Public Security Hospital,Tianjin300042,China; 3.Hebei Normal University of Science and Technology,Qinhuangdao066000,China; 4.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine Second Hospital,Tianjin300150,China

Objective To investigate the regulating effect of fire needling on Wnt and β-catenin genes of Wnt/β-catenin pathway in neural stem cells in spinal cord injury. Methods Sixty female SD rats were randomly allocated, including 5 rats to a blank group, 5 rats to a sham operation group, 25 rats to a model group and 25 rats to a fire needling group. The model and fire needling groups of rats were again separately divided into 1 d, 3 d, 7 d, 10 d and 14 d groups. A model was made using modified Allen’s method in the model and fire needling groups. The BBB score was recorded and the expressions of Wnt and β-catenin genes were determined in every group. Results In the model and fire needling groups, the BBB scores were significantly higher at 7 and 10 days than at the previous time point and there was a statistically significant difference (P＜0.05). The BBB score at every time point after treatment was significantly higher in the fire needling group than in the model group and there was a statistically significant difference(P＜0.05). Wnt3a gene expressions increased in the model and fire needling groups at 7 and 10 days compare with theprevious time point (P＜0.05). At 7 and 10 days, Wnt3a gene expression was higher in the fire needling group than in the model group and there was a statistically significant difference (P＜0.05). The changing tendency of β-catenin gene expression levels was basically the same as that of Wnt3a’s. Conclusion Fire needling can modulate the expressions of Wnt3a and β-catenin genes in neural stem cells in spinal cord injury.

Acupuncture therapy; Fire needling; Spinal cord injury; Wnt3a gene; β-catenin gene; Rats

R2-03

A

2017-04-11

10.13460/j.issn.1005-0957.2017.09.1121

1005-0957(2017)09-1121-04

国家自然科学基金面上项目(81373839)

徐家淳(1989—),男,2015级博士生,Email:xujiachunzhu@163.com

李岩(1970—),男,主任医师,博士,Email:liyan66950@sina.com