杜仲内生真菌Alternaria sp.抗菌活性部位筛选

吴聪慧，张振威，袁王俊

河南大学 中药研究所，开封 475004

杜仲内生真菌Alternariasp.抗菌活性部位筛选

吴聪慧，张振威，袁王俊

河南大学 中药研究所，开封 475004

〔目的〕 筛选杜仲内生真菌Alternariasp.的抗菌活性部位。〔方法〕 分别提取其发酵液的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇部位，采用纸片扩散法评价对病原菌的抑菌活性。〔结果〕 乙酸乙酯部位能有效抑制多种致病菌，具有广谱抗菌作用，正丁醇部位的抑菌效果次之，石油醚部位仅对个别测试菌有微弱抑菌效果。〔结论〕乙酸乙酯部位是杜仲内生菌Alternariasp.最主要的活性部位。

Alternariasp.，抑菌作用，活性部位

Abstract: 〔Objective〕To study the antibacterial activity site of endophytic fungusAlternariasp. 〔Methods〕A review by Disc diffusion method of the secondary metaboites were extracted from the fermentation broth by three different kinds of organic solvent, the petroleum ether, ethyl acetate and n-butanol.〔Results〕The ethyl acetate fraction could effectively inhibit a variety of pathogenic bacteria, with broad-spectrum antibacterial effect. The antibacterial effect of butanol part showed weaker than the ethyl acetate fraction. Petroleum ether parts of the individual test bacteria showed weakest inhibitory effect. 〔Conclusion〕Ethyl acetate extractive fraction is the best active part fromAlternariasp.

Keywords:Alternariasp., Bacteriostasis, agens site

内生真菌是在其生活史或生活史中某一段时间生活在植物组织内，但不会引起植物组织明显病害症状的真菌[1]。内生真菌不仅与宿主的次生代谢产物的合成有关，能直接影响药用植物的品质，还可产生具有特殊结构或者新颖的生物活性。内生真菌是一类筛选新医药、农药活性物质的重要微生物资源，在农业、医药及食品工业中具有很大的应用潜力[2]。

本课题组前期发现一株杜仲内生真菌Alternariasp.具有较好的抑菌作用。本研究拟筛选其抑菌活性部位，以期为杜仲内生真菌Alternariasp.抑菌活性成分的进一步筛选及新的抗菌药物的开发研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 菌种来源

杜仲内生真菌Alternariasp.由本课题组筛选。病原菌为金色葡萄球菌Staphylococcusaureus，大肠杆菌Escherichiacoli，蜡样芽孢杆菌Bacilluscereus，柑橘溃疡病菌XanthomonasCampestris，枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis，小麦赤霉病菌Fusariumgraminearum，禾谷镰刀菌Fusariumgraminearum，白色念珠菌Moniliaalbican均由河南大学中药研究所保存菌种。

1.2 方法

将内生真菌Alternariasp.接种于PDA液体培养基中，28 ℃，150 r/min摇床培养7 d左右，总发酵量为5 L。发酵结束后，将发酵液超声30 min后用布氏漏斗除去菌丝后离心10 min(12 000 rpm/min)，取上清液分别用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇等体积萃取3次，减压浓缩得到发酵液浸膏，精确称重。以甲醇做溶剂，配置成0.02 mg/L溶液，利用KB纸片法测试发酵产物的抑菌效果[3]。取20 μL溶液滴加在空白药敏纸片Φ=6 mm，充分饱和后，转接于涂布各病原菌检测平板中，作3个重复。置于恒温培养箱培养(生物检测平板：细菌37 ℃，24 h；真菌28 ℃，48 h)观察结果。设纯甲醇溶液为空白对照。

2 结果

内生真菌Alternariasp.不同提取部位浸膏量如下：石油醚部位0.639 2 g，乙酸乙酯部位1.449 3 g，正丁醇部位1.897 5 g。正丁醇和乙酸乙酯部位提取物量较多，石油醚部位量最少。

由表1可以看出，内生真菌Alternariasp.的石油醚，乙酸乙酯部位和正丁醇部位抗菌活性显著不一致。石油醚部位仅对柑橘溃疡病菌，蜡样芽孢杆菌有微弱抗菌效果。乙酸乙酯部位对供试致病菌均具有较好的抑菌活性，抑菌圈直径为16.03～23.19 mm，特别是柑橘溃疡杆菌抑菌圈达到23.19 mm，对禾谷镰刀菌抑菌圈也达到19.36mm；乙酸乙酯部位对白色念珠菌抑菌效果相对较差，但抑菌圈也达到16.03 mm，远远高出其他部位对白色念珠菌的抑菌活性。正丁醇部位也具有较好广谱抗菌作用，对各种致病菌均有抑作用，抑菌圈直径为1.05～15.13 mm，其中对柑橘溃疡病菌表现出较好的抑菌活性，抑菌圈达到15.13 mm，正丁醇部位对各种致病菌抑菌效果不如乙酸乙酯部位。总之，内生真菌Alternariasp.发酵液的乙酸乙酯部位不仅含量高而且抑菌活性强。

表1 内生真菌Alternaria sp.不同部位对7种致病菌的抗菌效果(mm)

注：所有测量均表示为平均值±标准差(n=3)，每行中不同字母表示差异显著(P<0.05)，“-”表示没有抑菌活性。

A.乙酸乙酯部位；B.正丁醇部位；C.石油醚部位；D.甲醇图1 内生真菌Alternaria sp.不同提取部位对柑橘溃疡病菌的抑菌效果

3 结论

内生真菌是一类筛选新医药、农药活性物质的重要微生物资源，在农业和天然药物研究开发和应用中具有应用潜力[4-5]。本研究筛选了一株抑菌效果好的杜仲内生真菌Alternariasp.发酵液的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇3个不同部位的抑菌活性。结果表明，内生真菌Alternariasp.发酵液乙酸乙酯部位的抑菌活性效果最好，其次为正丁醇部位。应优先从其发酵液的乙酸乙酯部位筛选活性成分。

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[4] 李昆太, 彭卫福, 周佳, 等. 一株产紫杉醇的南方红豆杉内生菌的分离与鉴定[J]. 江西农业大学学报, 2013, (35) 1: 184-188.

[5] 王利国, 潘超美, 贺红, 等. 抗肿瘤药用植物及其内生菌活性代谢产物研究进展[J]. 广州中医药大学学报, 2008, 3(25): 2.

[责任编辑段金卯]

ScreenofantibacterialactivitysitefromEucommiaulmoidesendophyticfungusAlternariasp.

WU Conghui, ZHANG Zhenwei, YUAN Wangjun

Institute of Chinese Materia Medica, Henan University, Kaifeng 475004, China

R927.1

A

1672-7606(2017)03-0174-03

2016-11-17

河南省教育厅自然科学重点项目(13A180057)

吴聪慧(1991-)，女，河南平顶山人，在读研究生，研究方向：中药资源。