福建黄兔INHBA基因5’端cDNA克隆及序列分析

桑雷 孙世坤 陈冬金 陈岩峰 谢喜平 （福建省农业科学院畜牧兽医研究所 350013）

福建黄兔INHBA基因5’端cDNA克隆及序列分析

桑雷 孙世坤 陈冬金 陈岩峰 谢喜平 （福建省农业科学院畜牧兽医研究所 350013）

为扩增福建黄兔INHBA基因5'端，根据GenBank上已公布的家兔序列KC831577，设计了2条巢式引物，利用5'RACE技术克隆福建黄兔INHBA基因5'端序列，获得1个682bp片段，对该片段克隆测序，获得包括5'UTR、第1外显子及部分第1内含子的片段。利用在线软件预测在-229～-180bp处存在可能的启动子，同时还发现9个潜在转录因子结合位点，其中包含对转录有重要调控作用的TATA-box位点。

福建黄兔；片段；克隆；INHBA；5'RACE；启动子；序列分析

抑制素属于TGF-β （transforming growth factor-bata，转化生长因子-β）超家族成员之一，由α、β两个亚基组成的二聚体糖蛋白激素，此类激素通过负反馈调节FSH（follicle stimulating hormone，卵泡雌激素）合成与分泌，从而影响卵泡发育和精子发生[1,2]。抑制素β亚基有βA和βB两种形式，其中α亚基和βA组成抑制素A，此外βA与自身通过二硫键连接组成活化素A（Activin A，ACTA）以及与βB亚基组成活化素B（Activin B，ACTB）[3]。在母畜中，抑制素βA是影响山羊、绵羊产羔数的重要基因[4,5]。在公畜中，抑制素βA是影响荷斯坦公牛射精量及精子密度的重要因素[6]。目前对福建黄兔INHBA基因研究甚少，尤其cDNA 5’UTR(untranslated region，非翻译区)序列未见有报导，本研究目的是解析福建黄兔INHBA基因启动子序列及结构特征，为进一步研究福建黄兔INHBA基因调控与繁殖性状的关联分析提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物及组织

性成熟的福建黄兔母兔由福建连江玉华山生态试验场购买。黄兔母兔屠宰后立刻取卵巢组织，放入液氮罐中，备用。

1.2 总RNA提取

使用RNAiso Plus（Takara）提取黄兔卵巢组织中的总RNA，然后用不含RNA酶的Recombiant DNase I(Taraka)去除基因组DNA，随后溶于DEPC水，中保存于-20℃备用。

1.3 引物设计及合成

本试验以已获得的INHBA cDNA部分序列 （KC831577）设计引物扩增5’端序列[7]，由上海生工合成，引物的部分序列见表1。

1.4 5'RACE前处理及反转录

使用Takara 5’Full RACE Kit with TAP对5μg的总DNA进行CIAP、TAP处理，并与5’RACE Adaptor连接后，反转录合成cDNA。cDNA反转录体系：连接好的RNA 6μl，随机 引 物（ 50μM） 0.5μl， dNTPs Mixture(各 10mM)1μl，RNase Inhibitor （40U/μl） 0.25μl， 5×M-MLV buffer 2μl， Reverse Transcriptase M-MLV （200U/μl） 0.25μl。 RT 反应条件为：30℃下10min，42℃下60min，70℃下15min，反应结束后将cDNA产物保存于-20℃备用。

1.5 PCR扩增

取上述反转录反应液稀释5倍取2μl，10μM上、下游引物 （INHBA 1， Outer primer） 各 2μl， 2×GC buffer 25μl， 5U/μl LA TaqⓇ（Takara） 0.5μl， 用水补足至 50μl体系。 反应条件为： 94℃下 3min； 94℃下 30s， 60℃下 30s， 72℃下 2min，30个循环；72℃下10min。取上述PCR产物1μl作为模板，上、 下游引物 （INHNA 2， Inner primer） 各取 2μl， dNTP（各 2.5mM） 8μl， 2×GC buffer25μl， 5U/μl LA TaqⓇ（Takara）0.5μl，用水补足至50μl体系。反应条件为：94℃下3min；94℃下 30s， 60℃下 30s， 72℃下 2min， 30个循环； 72℃下10min。取5μl进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6 克隆测序

将胶回收试剂盒切胶回收的PCR产物 （约700bp）与pMD18-T载体连接后转染至DH5α细胞中，涂平板37℃培养12h，挑选阳性克隆用PCR法鉴定重组质粒。随后将鉴定过质粒送至宝生物工程 （大连）有限公司进行测序。

2 结果与分析

2.1 兔INHBA基因5'UTR区扩增

经过1%琼脂糖凝胶电泳，结果显示，3’RACE产物为大约700bp的条带 （图1），与预期的产物大小一致。将扩增产物送至宝生物工程 (大连)有限公司进行测序，最后得到1个682bp片段。从获得序列分析结果来看，所获得序列包含1个5’UTR(280bp)，第1外显子 （288bp）以及部分第1内含子 （14bp）（见图2）。

图1 黄兔INHBA 5’端扩增产物琼脂糖电泳

图2 福建黄兔INHBA基因5’UTR区序列分析

2.2 兔INHBA基因的生物信息学分析

将测序得到的兔INHBA基因5’UTR区序列用BDGP∶NeuralNetwork PromoterPrediction （ http∶//www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）进行启动子位点预测，发现在-229～-180bp处存在可能的启动子位点，得分为0.92，具体位置见图2。

将测序得到的兔INHBA基因5’UTR序列用BIMAS网站的 Promoter Scan （https∶//www-bimas.cit.nih.gov/molbio/） 预测转录结合位点，发现9个潜在的转录因子结合位点 （表2），其中-273bp处存在 3种TFFIID结合位点，分别为TATA-box.2、 Ad2MLP US.5、 TATA-box-CS， 其中 TATA-box.2为真核生物共有的转录结合位点，Ad2MLP US.5、TATA-box-CS为哺乳动物特有的TFIID结合位点，-208bp、-206bp存在激活蛋白AP-2（activator protein-2）结合位点，此外还存在 glucagon-G3A （-230bp）、 UCE.2 （-227bp）、JCV_repeated_sequence（-58bp）转录结合位点。

表1 PCR引物扩增序列

表2 转录结合因子

3 讨论

TFIID（Transcription factor IID，转录因子IID）由TBP（TATA-box binding protein，TATA结合蛋白）和多种TBP协同因子 （TBP-associated factors，TAFs）组成，是真核生物中唯一具有位点特异的DNA结合能力的因子。TFIID能识别TATA位点并与之结合，形成TFIID-启动子复合物，指导其他转录因子与RNA聚合酶II形成转录起始复合物 (transcriptional preinitiation complex），引发RNA的合成过程[8]。UCE(upstream control element，上游控制元件)，与核心启动子（core promoter） 一起被 UBF （upstream binding factor， 上游结合因子）结合，再与SL1（selectivity factor 1，选择性因子1）一起促进转录[9]。GCF（GC binding factor，GC结合因子）是一种转录抑制因子，通过与上游启动子中富含GC序列的区域特异结合，进而抑制基因的转录[10]。AP-2（activator protein-2，激活蛋白-2）是一种DNA结合蛋白，参与调控多种基因转录及细胞增殖、分化、凋亡[11]。Csh1、PRP-I及PAG1等基因上游有AP-2结合位点，相关研究发现Csh1、PRP-I及PAG1与胎盘子叶和胚胎发育相关，敲除小鼠胚胎细胞AP-2基因会导致合体滋养层细胞丧失增殖能力[12,13]。研究发现人滋养层细胞的hCG、hCSH1和hGRH等基因上游区域存在AP-2结合位点，这些基因的特异表达受AP-2家族的调控[14,15]。INHBA基因上GCF和AP-2位点是否与表达调控相关，有待进一步的验证。

4 小结

本研究利用5’RACE技术获得INHBA基因5’端1个682bp片段，通过克隆测序获得了其5’UTR序列。通过在线分析软件预测福建黄兔INHBA基因转录因子结合位置及启动子序列，为进一步研究福建黄兔INHBA在生殖轴中的表达机制奠定了理论基础。

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项目资金：福建省公益类研究院所专项 “闽西南黑兔FABP4基因的克隆、多态性及与生长、肉质性状的关联分析”（2015R1023-13）；福建省农业科学院科技创新团队PI项目 “家兔优良品种资源创新育种研究”（2016PI-11）；福建农业科学院杰出青年人才基金 “闽西南黑兔FABP4基因的克隆、多态性及与生长、肉质性状的关联分析”（2014JQ-1）。

桑雷 （1981-），男，汉族，博士，助理研究员，从事草食动物遗传育种与繁殖工作。