有限稀释法分离纯化人牙周膜干细胞的实验研究

任娅岚　张湘宜　陈思思　白玲　刘春竹　刘亚丽

摘要：目的 体外分离培养人牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells， PDLSCs）并进行鉴定。方法 采用有限稀释法分离和纯化PDLSCs并通过克隆形成及多向分化实验，鉴定所得细胞的增殖和分化能力。结果 分离纯化所得细胞均为长梭形或者不规则形，克隆细胞呈旋涡状集落生长趋势，体外诱导条件下可向成骨细胞、脂肪细胞分化，具有干细胞增殖和多向分化的特性。结论 有限稀释法分离纯化的PDLSCs具有间充质干细胞的表型及增殖和多向分化的生物学特性。

关键词：有限稀释法；人牙周膜干细胞；克隆形成；诱导分化

中图分类号：R781.4 文献标识码：A 文章编号：1006-1959（2017）18-0043-02

Abstract：Objective To isolate and culture the human periodontal ligament stem cells（PDLSCs）in vitro and to identify them.Methods PDLSCs were isolated and purified by limiting dilution method.The proliferation and differentiation ability of the obtained cells were identified by clonal formation and multidirectional differentiation experiments.Results The purified cells were fusiform or irregular in shape，cell clone was spiral colony growth trend under induction to osteoblasts，adipocytes，with characteristics of proliferation and multi cell differentiation.Conclusion PDLSCs isolated and purified by limited dilution method have the phenotype of mesenchymal stem cells and the biological characteristics of proliferation and multi-directional differentiation.

Key words：Finite dilution method；Human periodontal ligament stem cells；Clonal formation；Induction differentiation

牙周病是一种慢性炎症骨吸收疾病，是造成成年人牙齿丧失最主要的原因 [1-2]。牙周病治疗的关键是控制感染和诱导牙周支持组织修复和再生。组织工程学利用牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）修复和再生病变牙周组织已成为牙周病治疗的新手段[3]，使PDLSCs需求逐步增大。本研究在酶消化法培养原代牙周膜细胞的基礎上进行了探索和改良，利用单细胞接种的有限稀释法克隆化分离纯化PDLSCs，并对所得干细胞进行了相应的鉴定，为PDLSCs的深入研究和应用奠定了基础。

1材料和方法

1.1主要试剂和仪器

α-MEM培养基（Gibco，美国）、胎牛血清（杭州四季青公司）、Ⅰ型胶原酶、甲苯胺蓝、2.5 g/L胰蛋白酶、抗坏血酸、地塞米松、β-甘油磷酸钠、茜素红、油红O（Sigma，美国）、倒置相差显微镜以及照相系统（Olympus，日本）。

1.2取材和细胞原代培养

1.2.1取材和原代培养 收集因正畸需要拔除的牙体牙周健康的前磨牙，年龄29～38岁。拔牙后用锐利刀片剥离牙根表面的牙周膜组织，接种至六孔培养板内，培养1～2 w，直至有细胞从组织块边缘爬出。细胞达80%时消化传代。

1.2.2有限稀释法分离纯化人牙周膜干细胞 取第1代细胞悬液，吹打均匀接种于96孔培养板，培养过夜标记单个细胞孔，待克隆达孔底面积的 1/3～1/2时，消化混合，形成多克隆PDLSCs，体外扩大继续培养。第3～5代多克隆来源的PDLSCs用于本实验研究。

1.3牙周膜干细胞的鉴定

1.3.1细胞克隆形成能力 取第3代PDLSCs接种于9 cm培养皿中常规培养。显微镜下观察细胞的克隆形成情况。14 d终止培养，弃培养液，多聚甲醛固定15 min，观察计数，>50个细胞的集落记为1个克隆。

1.3.2成骨分化能力分析 取第3代细胞接种6孔培养板，待60%以上融合时，更换矿化培养液诱导21 d。多聚甲醛固定，茜素红染色镜下观察。使用图像分析软件Image-Pro Plus 5.0（Media Cybernetics，美国）计算矿化结节面积。

1.3.3成脂分化能力分析 取对数生长期第3代细胞接种于6孔培养板，90%以上融合时，更换成脂诱导液培养14 d。多聚甲醛固定，油红O染色，图像分析。

1.4统计学分析

使用SPSS17.0软件进行统计分析，两独立样本均数比较用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PDLSCs分离纯化

3～7 d组织块周围有原代细胞爬出。有限稀释单克隆挑选培养的PDLSCs呈典型的纺锤形，成簇螺旋生长，培养3 d后细胞可达到90%汇合，14 d后克隆形成，见图1。

2.2成骨分化能力分析endprint

经成骨诱导液培养7 d后，复层生长的 PDLSCs 基质中可见褐色结节，并随时间逐渐增多。培养14 d，茜素红染色，显示PDLSCs矿化结节，见图2。

2.3成脂分化能力分析

经成脂诱导液培养7 d后，即可见细胞中有黄色小脂滴出现，主要集中于细胞核周围。诱导14 d时，油红O染色可见脂滴呈橘红色，见图3。

3 讨论

牙周膜干细胞具有成体干细胞自我更新和多向分化的特点，是牙周组织工程的重要种子细胞。研究者从正常[4]、老年人[5]、糖尿病[6]和慢性牙周炎[7-8]的牙周膜组织中分离出了PDLSCs。学者们利用各种不同的方法分离和培养PDLSCs。常用的方法有免疫磁珠分选法、流式细胞分选方法、有限克隆稀释法。

免疫磁珠法是Seo等学者使用的PDLSCs分离方法，其分离细胞的原理是通过免疫学抗原抗体结合作用达到分离的目的，此方法的缺点是价格昂贵，分选效率低等[9]。流式细胞仪分离法其原理是利用不同大小的细胞带有不同電荷，进入电场中的偏离角度不同达到分离目的[10]。该方法分离速度快，但缺点是需特殊的仪器，且价格昂贵，要求细胞数量多。

考虑到细胞量、费用和细胞纯度等多方面的因素，本研究使用有限稀释法。分离纯化所得到的PDLSCs均为间充质干细胞的长梭形或者不规则形，能形成呈放射状或者为旋涡状集落生长单细胞克隆，克隆形成率高的细胞也具有高增殖能力。分化实验显示，PDLSCs可以向成骨和脂肪细胞分化，说明分离纯化所得的细胞具有干细胞多向分化的能力，与其它的研究结果相一致。与其它方法相比，有限稀释法是一种相对简单的干细胞分离方法。此方法不需要特殊设备，实验耗费小，适合大批量的克隆纯化培养。

因此，有限稀释法操作简单，所得的PDLSCs来源可靠，细胞的生物学特性均一，保证了实验用细胞的稳定性，是对PDLSCs的深入研究和应用提供细胞来源的有效干细胞分离纯化方法。

参考文献：

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