磷脂酰肌醇3激酶、蛋白激酶B、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白在帕金森病模型大鼠黑质区的表达①

胡馨月，刘斌，徐佳莉，张晋霞

磷脂酰肌醇3激酶、蛋白激酶B、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白在帕金森病模型大鼠黑质区的表达①

胡馨月，刘斌，徐佳莉，张晋霞

目的 观察磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路相关蛋白在帕金森病模型大鼠黑质区的表达及变化情况。方法 96只健康Sprague-Dawley大鼠随机分为假手术组、模型组、PI3K抑制剂LY294002组及p-mTOR抑制剂雷帕霉素组，每组又分为模型制备成功后4 d和8 d两个亚组，每个亚组12只。后三组颈背部皮下注射鱼藤酮制作帕金森病大鼠模型，相应时间点免疫组化及Western blotting检测大鼠黑质区PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达。结果 与假手术组比较，模型组各时间点PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表达增加(P＜0.05)，8 d亚组高于4 d亚组(P＜0.05)。与模型组比较，LY294002组各时间点p-Akt、p-mTOR蛋白表达减少(P＜0.05)，PI3K蛋白表达无明显变化(P＞0.05)；雷帕霉素组各时间点p-mTOR蛋白表达下降(P＜0.05)，PI3K、p-Akt蛋白表达无明显变化(P＞0.05)。结论 黑质PI3K/Akt/mTOR信号通路激活可能是帕金森病发生、发展的重要机制之一。

帕金森病；磷脂酰肌醇3激酶；蛋白激酶B；哺乳动物雷帕霉素靶蛋白；黑质；大鼠

帕金森病是好发于中老年人的慢性神经系统退行性疾病，发病率逐年增加，主要病理改变是黑质致密部多巴胺能神经元变性和缺失[1]，病因及确切的发病机制尚未明确。近年研究发现，帕金森病与细胞自噬关系密切[2-6]。

磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,又称Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是体内蛋白质合成的重要信号通路，在自噬中发挥重要调节作用[7]。PI3K是一种存在于细胞质的复合体，在多种生长因子刺激下可被激活，是信号通路的重要组成分子。Akt是由480个氨基酸残基组成的蛋白质，是PI3K下游蛋白的关键分子，在该信号传导通路中起关键作用。mTOR是一种含有2549个氨基酸残基的蛋白分子，为Akt下游底物。p-Akt和p-mTOR是Akt及mTOR的活化形式。本研究检测PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白PI3K、p-Akt和p-mTOR在帕金森病模型大鼠黑质区的表达，探讨其在帕金森病发生、发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康雄性Sprague-Dawley大鼠96只，体质量250～300 g，由中国人民解放军军事医学科学院提供，合格证号SCXK-(军)2014-0001。在华北理工大学屏障环境动物实验室自由喂养，室温(23±2)℃，自然光照，适应喂养2周。

将大鼠编号，用随机数生成器随机抽取不同数字，将大鼠随机分为假手术组、帕金森病模型组(模型组)、PI3K抑制剂2-(4-吗啉基)-8-苯基-4氢1苯并吡喃-4-酮(LY294002)组及mTOR抑制剂雷帕霉素组，每组又分为模型制备成功后4 d和8 d两个亚组，每个亚组12只。

1.2 主要试剂及仪器

鱼藤酮、葵花油：北京博奥森生物工程有限公司。PI3K、p-Akt及p-mTOR兔抗鼠多克隆抗体：ARIGO公司。免疫组化检测试剂盒：北京中杉金桥生物技术有限公司。EG1150 H型组织包埋机：LEICA公司。BX53全自动显微镜扫描系统：OLYMPUS公司。

1.3 侧脑室注射

LY294002组10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉后，将鼠头固定于立体定向仪上，切开头皮，分离皮下组织，10%H2O2擦试颅骨，充分暴露前囟“十”字交叉骨性结构。在前囟点旁开0.9 mm，向后1.5 mm，用微型牙科钻打孔，有明显穿透感后拔出，到达硬脑膜表面。微量进样器抽吸10 mmol/L LY294002溶液10µl，沿钻孔缓慢进针，深3.8 mm，在5 min内匀速缓慢注完，留针5 min后缓慢拔针。

雷帕霉素组同法注射8 ng/µl雷帕霉素4µl。

模型组和假手术组同法注射等体积生理盐水。

1.4 模型制备

侧脑室注射后，采用颈背部皮下注射鱼藤酮制备帕金森病大鼠模型[8]。鱼藤酮以葵花油配制成2 mg/ml乳液，充分震荡混匀后避光保存。模型组、LY294002组及雷帕霉素组大鼠称体质量后，每只大鼠每天予鱼藤酮2 mg/kg颈背部皮下注射；假手术组每天颈背部皮下注射等量葵花油，直至出现行为学改变造模成功[9]后停止注射。选择评分2～6分者为实验大鼠。

术中大鼠肛温维持36.5～37.5℃。术后连续腹腔注射庆大霉素1万U/kg，共3 d，预防感染。

1.5 免疫组化染色

造模成功后4 d和8 d，各组分别取6只大鼠，10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉。剑突下横切口约2～3 cm，向上剪断3根肋骨，暴露心脏；剪开右心耳，经心脏灌注4℃生理盐水100～200 ml至肝脏完全变白，灌注4%多聚甲醛150～200 ml，至大鼠肝脏变硬、肢体僵直。迅速断头取脑组织，4%多聚甲醛中固定过夜。按《大鼠脑立体定位图谱》[10]取大鼠黑质区，常规脱水，石蜡包埋。连续切片，厚4 μm，捞片后60℃烤箱烘干2.5 h。

切片脱蜡至水，3%H2O2常温孵育10 min，灭活内源性过氧化物酶。加0.01 mmol/L柠檬酸盐缓冲液(pH=6.0)，微波煮沸10 min，冷却至室温。羊血清封闭，室温孵育10 min。加入PI3K(1∶300)、p-Akt(1∶400)、p-mTOR(1∶200)一抗，4℃冰箱过夜；加入生物素化二抗，37℃孵育30 min。加入辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素溶液，室温孵育15 min。DAB显色，苏木素复染。常规脱水，透明，干燥，封片。光镜下，以细胞质或核出现黄色或棕黄色颗粒样物质为阳性。高倍镜下观察各组大鼠黑质区不重叠的6个视野，行PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白阳性细胞计数，取平均值。

1.6 Western blotting

各级其余6只大鼠，10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉。断头后于冰上开颅取脑，冷PBS漂洗残余血，立即分离出新鲜纹状体，将蛋白酶抑制剂PMSF 4µl加入冷RIPA组织裂解液1 ml中，混匀，冰上备用。取脑组织标本加入含PMSF的裂解液中，体积比1∶3混合，匀浆器充分匀浆，冰上裂解40 min；4℃、12,000 r/min离心15 min。取上清，转移到另一离心管中，-80℃保存备用。

取蛋白样品每个泳道50µg，经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酸铵凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分离后，半干转法电转移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)上，转移缓冲液甘氨酸5.8 g、Tris 2.9 g、SDS 0.37 g，重蒸馏水800 ml溶解后加入甲醇200 ml。PVDF膜封闭液中封闭，加入PI3K、p-Akt、p-mTOR一抗(1∶1000)4℃孵育过夜。PBS洗膜，加入羊抗兔二抗(1∶2000)，37℃ 1 h；洗膜。ECL显色，胶片曝光显影。采用Image J软件分析目的蛋白条带与内参蛋白β-action的相对光密度(OD)。

1.7 统计学分析

采用SPSS 20.0统计软件进行统计分析。数据以(xˉ±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD-t检验。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 免疫组化

与假手术组比较，模型组各时间点PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表达增加(P＜0.05)，8 d组高于4 d组(P＜0.05)。与模型组比较，LY294002组各时间点p-Akt、p-mTOR蛋白表达减少(P＜0.05)，PI3K蛋白表达无显著性差异(P＞0.05)；雷帕霉素组各时间点p-mTOR蛋白表达下降(P＜0.05)，PI3K、p-Akt蛋白表达无显著性差异(P＞0.05)。见表1～表3，图1～图3。

2.2 Western blotting

与假手术组比较，模型组各时间点PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表达增加(P＜0.05)，8 d组高于4 d组(P＜0.05)。与模型组比较，LY294002组各时间点p-Akt、p-mTOR蛋白表达减少(P＜0.05)，PI3K蛋白表达无显著性差异(P＞0.05)；雷帕霉素组各时间点p-mTOR蛋白表达下降(P＜0.05)，PI3K、p-Akt蛋白表达无显著性差异(P＞0.05)。见表4～表6，图4。

表1 各组造模后4 d、8 d免疫组化PI3K表达(/高倍视野)

表2 各组造模后4 d、8 d免疫组化p-Akt表达(/高倍视野)

表3 各组造模后4 d、8 d免疫组化p-mTOR表达(/高倍视野)

表4 各组造模后4 d、8 d Western blotting PI3K表达(OD)

图1 各组各时间点PI3K表达(免疫组化染色，bar=20 μm)

图2 各组各时间点p-Akt表达(免疫组化染色，bar=20 μm)

图3 各组各时间点p-mTOR表达(免疫组化染色，bar=20 μm)

图4 各组各时间点PI3K、p-Akt和p-mTOR表达(Western blotting)

表5 各组造模后4 d、8 d Western blotting p-Akt表达(OD)

表6 各组造模后4 d、8 d Western blotting p-mTOR表达(OD)

3 讨论

帕金森病的病因及确切的发病机制尚未明确，可能与年龄、遗传、环境、细胞凋亡、自噬、氧化应激、线粒体功能衰竭、钙超载、兴奋性氨基酸毒性等有关[1,11-13]。自噬在帕金森病的发生、发展过程中起重要作用[2-6]。自噬受多种信号通路的调控，PI3K/Akt/mTOR信号通路是其中重要信号调控通路[14]。

PI3K是真核生物细胞膜的组成部分，可以磷酸化肌醇磷脂肌醇环上的3'-OH，其家族包括许多脂质激酶；激活的PI3K可促进细胞存活，抑制凋亡[15]。Akt作为PI3K的主要底物之一，参与神经细胞的迁移、存活等过程，并对神经元大小具有调节作用。mTOR广泛存在于细胞质内，主要依据细胞营养状态调节信号，控制下游与翻译、转录等有关的多种蛋白的磷酸化，在细胞生存、生长和增殖中起调控作用。Akt是PI3K下游直接靶点蛋白，受上游PI3K的激活、磷酸化；活化的Akt可以直接激活mTOR，进而作用于下游靶蛋白，调控mRNA翻译效率，从而增加一系列与细胞生长、分化相关的蛋白表达[7,16-17]。

PI3K/Akt/mTOR信号通路在神经元的发育、生存和功能方面十分重要，多种基因/蛋白参与帕金森病的发病，直接影响中脑黑质多巴胺含量[18-19]。该信号通路也参与细胞自噬和分解异常蛋白，在对抗神经退行性疾病神经元凋亡中发挥重要作用[20]。本研究显示，帕金森病模型大鼠黑质区高表达PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白，提示PI3K/Akt/mTOR通路相关蛋白在帕金森病发病过程中发挥了重要作用。这与Khwanraj等[21]的研究结果基本一致。

LY294002是一种人工合成的PI3K特异性抑制剂，可靶向抑制PI3K催化P110亚基的活化，从而抑制下游底物[22]。雷帕霉素是大环内酯类抗生素，靶向抑制mTOR活性，调节线粒体功能，延长时序寿命，减少神经元凋亡[23-24]。赵明明等[25]在神经元机械性损伤中，Western blotting发现造模后3 h Akt达高峰，应用LY294002干预后Akt明显降低。Malagelada等[26]报道，雷帕霉素可以减少6-羟多巴对PC12细胞的毒性，并增加1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶诱导的帕金森病小鼠黑质中多巴胺能神经元存活。本研究显示，应用LY294002及雷帕霉素特异性抑制剂阻断该通路后，帕金森病模型大鼠黑质区相应时间点p-Akt和p-mTOR蛋白阳性表达减少。

综上所述，PI3K/Akt/mTOR信号通路在帕金森病中过度表达，可能在帕金森病的发生、发展中起重要作用。使用此通路的抑制剂可能会对控制帕金森病的进展产生积极影响，可能为帕金森病的治疗提供新的干预靶点。

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Expression of Phosphatidylinositol 3-Kinase,Protein Kinase B and Mammalian Target of Rapamycin in Substantia Nigra in Rats with Parkinson's Disease

HU Xin-yue,LIU Bin,XU Jia-li,ZHANG Jin-xia
First Department of Neurology,the Affiliated Hospital of North China University of Science and Technology,Tangshan,Hebei 063000,China

LIU Bin.E-mail:liubintsh@126.com

Objective To observe the expression of phosphatidylinositol 3-kinase(PI3K)/protein kinase B(Akt)/mammalian target of rapamycin(mTOR)signaling pathway in substantia nigra in rats with Parkinson's disease(PD).Methods A total of 96 Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group,model group,PI3K inhibitor LY294002 group and mTOR inhibitor rapamycin group.Each group was divided into 4 days and 8 days subgroups after the model.PD model was established by injecting rotenone subcutaneously.The expression of PI3K,p-Akt and p-mTOR in substantia nigra was detected with immunohistochemistry and Western blotting.Results Compared with the sham group,the expression of PI3K,p-Akt and p-mTOR increased in the model group(P＜0.05),and was more in 8 days subgroup than in 4 days subgroup(P＜0.05).Compared with the model group,the expression of p-Akt and p-mTOR reduced in the LY294002 group(P＜0.05),while the expression of PI3K varied little(P＞0.05);the expression of p-mTOR decreased in the rapamycin group(P＜0.05),while the expression of PI3K and p-Akt varied little(P＞0.05).Conclusion PI3K/Akt/mTOR signaling pathway is over activated in substantia nigra in rats with Parkinson's disease,which may play an important role in occurrence and development of the disease.

Parkinson's disease;phosphatidylinositol 3-kinase;protein kinase B;mammalian target of rapamycin;substantia nigra;rats

R742.5

A

1006-9771(2017)09-1043-08

2017-01-10

2017-04-01)

10.3969/j.issn.1006-9771.2017.09.011

[本文著录格式] 胡馨月，刘斌，徐佳莉，等.磷脂酰肌醇3激酶、蛋白激酶B、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白在帕金森病模型大鼠黑质区的表达[J].中国康复理论与实践,2017,23(9):1043-1050.

CITED AS:Hu XY,Liu B,Xu JL,et al.Expression of phosphatidylinositol 3-kinase,protein kinase B and mammalian target of rapamycin in substantia nigra in rats with Parkinson's disease[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian,2017,23(9):1043-1050.

河北省医学科学研究重点课题(No.20130064)。

华北理工大学附属医院神经内一科，河北唐山市063000。作者简介：胡馨月(1989-)，女，汉族，河北承德市人，硕士研究生，医师，主要研究方向：帕金森病及相关疾病。通讯作者：刘斌，男，硕士，主任医师，教授，研究生导师。E-mail:liubintsh@126.com。