TPX2基因在乳腺癌病理进展和放疗中作用机制研究

黄超有 吴德华 韩 铮 朱珊珊

（南方医科大学，广州白云510515）

TPX2基因在乳腺癌病理进展和放疗中作用机制研究

黄超有 吴德华 韩 铮 朱珊珊

（南方医科大学，广州白云510515）

目的 研究TPX22基因对乳腺癌病理进程和放疗的影响及作用机制。方法 建立乳腺肿瘤干细胞裸鼠移植瘤模型，根据是否接受细胞放射干预分为干预组和未干预组，采用免疫组化法检测两组乳腺癌细胞裸鼠模型接受放疗干预前后TPX22基因蛋白表达水平，并检测TPX2相关靶基因（Bcl-2、Bax、p21及p53）在乳腺癌组织中的蛋白表达，分析TPX2与其相关靶基因蛋白的相关性。结果 两组乳腺肿瘤裸鼠模型右腋下均有显著移植瘤生长，肿瘤组织与周围正常组织分解清晰，移植瘤组织内有大量肿瘤细胞弥漫性分布，肿瘤细胞形态不规则。干预组接受放疗后TPX2阳性率50%，对照组87.5%。TPX2与Bcl-2表达水平呈显著正相关性（RBcl-2=0.9688），与Bax、p21及p53呈显著负相关性（RBax=-0.9675、Rp21=-0.9563、RP53=-0.9742）。结论 TPX2在乳腺癌细胞中呈高表达，可能通过调控Bcl-2、Bax、p21及p53等相关靶基因表达水平，参与疾病进展，影响放疗效果，TPX2有望成为乳腺癌治疗的新靶点。

TPX2基因；乳腺癌；病理进程；放疗；机制

乳腺癌是临床常见的恶性肿瘤，TPX2属苏氨酸家族新发现的癌基因，有研究发现TPX2可通过多种途径参与肿瘤细胞生长[1]，在癌细胞损伤、修复及凋亡过程中发挥重要作用。乳腺癌肿瘤干细胞是其放疗抵抗的关键，既往资料显示TPX2与肿瘤干细胞增殖密切相关[2]，但目前临床尚缺乏TPX2在乳腺肿瘤干细胞中的表达及其在放疗中作用的机制研究。为此，本研究通过动物实验观察TPX2在乳腺肿瘤干细胞中的表达，并进一步分析其在乳腺癌病理进程和放疗中作用机制，为乳腺癌新治疗靶点的寻找提供依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料：实验裸鼠16只，均由广东省医学实验动物中心提供，干预组和未干预组各8只，干预组体重 40～76 g，平均（58.4±10.2）g；雌性 5 只，雄性 3 只。未干预组体重 38～78 g，平均（59.0±9.7）g；雌雄性各4只。两实验组基本资料无显著性差异（P＞0.05）。

1.2 实验方法：①建立乳腺肿瘤裸鼠模型：在10%胎牛血清和160 U/L胰岛素PRMH640培养液中培养人乳腺癌细胞株MCF-7，收集对数生长期细胞悬液。在SPF环境下将细胞悬液接种至裸鼠背部皮下，0.1 mL/只。待肿瘤生长至肉眼可见后，切取肿瘤组织，处死裸鼠；②细胞放射干预：取组织病理细胞，在温室下用 137Csirradiator照射，剂量率 0～32 Gy/min，距放射源100 cm，照射完成后在室温37℃、5%CO2条件下进行细胞培养；③免疫组化：每一病理切片连续切取4 μm厚切片，60℃烤片2 h，石蜡切片脱蜡水化，PBS 浸泡 5 min，3%H2O2温室孵育 5 min，再用PBS浸泡5 min，用EDTA抗原修复液高压修复3 min，一抗稀释后，4℃环境下过夜。PBS冲洗，3 min×3次，加入过氧化物酶标记的抗鼠IgG二抗，室温孵育20 min，PBS冲洗后，用DAB显色剂显色，冲洗，苏木素复染，脱水。判断标准：高倍镜下观察染色结果，无染色为阴性（-）、浅黄色为弱阳性（+）、棕黄色为阳性（++）、黄褐色为强阳性（+++）。

1.3 统计学处理：选用SPSS19.0统计学软件，计量资料以均数±标准差表示，计数资料以率（%）表示，组间比较行t或χ2检验，相关性分析采用线性回归分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌裸鼠模型染色：两组裸鼠右腋下均有显著移植瘤生长，肿瘤组织病理切片见图1，肿瘤组织与周围组织分解清晰，移植瘤组织内有大量肿瘤细胞弥漫性分布，肿瘤细胞形态不规则，细胞核异型，详见图1。

图1 染色后的裸鼠肿瘤细胞

2.2 TPX2在两组乳腺癌裸鼠模型中表达：干预组和未干预组放疗前后TPX2表达水平详见表1。

表1 两组TPX2表达水平

2.3 TPX2表达水平与其相关靶基因相关性：TPX2与Bcl-2呈显著正相关性，与Bax、p21及p53呈显著负相关性（P＜0.05）。

3 讨论

TPX2是受细胞周期严格调控的核增殖相关蛋白，分布于S期和G2期，在肿瘤细胞有丝分裂过程中发挥重要作用。既往已有研究证实TPX2在食管癌、宫颈癌、肺癌等多种恶性肿瘤中呈现高表达[3]，其表达水平与肿瘤生物学行为密切相关。刘万伟等[4]认为TPX2是机体重要的凋亡调节因子，参与DNA组织损伤修复过程。本研究也显示，乳腺癌裸鼠模型中TPX2均呈阳性表达，且在放疗干预后阳性表达率显著降低，故推测TPX2高表达可作为乳腺癌的高危因素，其表达水平对判断患者预后具有一定的预测价值。有研究还认为TPX2可通过上调JAK2和STAT1 表达，下调细胞周期蛋白（Cycline）水平[5]，增强肿瘤侵袭能力。张春梅[6]利用RT-PCR检测tpx2m RNA表达水平，发现其在乳腺癌中的表达水平显著高于癌旁和正常组织，与本文结论相符。

Bcl-2位于人染色体的18q21，属抑制细胞凋亡的原癌基因。王美玲[7]认为Bcl-2作用于线粒体PT孔有关蛋白，阻断PT孔开放，维持跨膜电位，同时减少细胞色素C释放。汤少鹏[8]利用Western blot检测发现TPX2siRNA载体细胞Bcl-2和Cyclin表达下调，从而抑制EC1细胞增殖，降低穿透Matrigel肿瘤细胞，诱导细胞凋亡。高德全等检测胃癌组织Bax和Bcl-2水平，认为上调Bax，可激活caspase-3，诱导肿瘤细胞凋亡[9]。本研究发现，TPX2表达水平与Bcl-2表达水平呈显著正相关性，而与Bax呈负相关性。故推测TPX2和Bax具有负向协同调控作用，TPX2可能通过调控Bax和Bcl-2水平，促进肿瘤进展。

综上所述，TPX2在乳腺癌细胞中呈高表达，TPX2可能通过调控Bcl-2、Bax、p21及p53等靶基因蛋白，在肿瘤进展和接受放疗后影响其病理进程。

［1］ 沈亮，许一鸣，丁胜光，等.TPX2在食管胃交界部腺癌中的表达及其与侵袭转移的相关性［J］.中华临床医师杂志，2016，10（11）：1505-1510.

［2］ 梁博，黄毓，何华，等.TPX2在肝细胞癌组织中的表达及其临床意义［J］.中华医学杂志，2015，95（6）：408-411.

［3］ 常海平，王敬芝，田原，等.TPX2在宫颈癌中的表达及意义［J］.基础医学与临床，2012，32（5）：561-565.

［4］ 刘万伟，李恩亮，邬林泉，等.TPX2在细胞间期参与DNA损伤反应及其与肿瘤发生关系的研究进展［J］.广东医学，2016，37（8）：1245-1248.

［5］ 才保加，祁玉娟，周为，等.结肠腺癌患者癌组织中TPX2、PTEN和Ki67的关系及临床意义［J］.中国老年学杂志，2014，16（9）：2399-2401.

［6］ 张春梅，李敏，周仕娴，等.乳腺癌组织中TPX2蛋白的表达及其临床意义［J］.临床与实验病理学杂志，2015，9（5）：528-531.

［7］ 王美玲.Bax、Bag-1、Bcl-2在乳腺肿瘤组织中的表达及意义［J］.海南医学院学报，2014，20（11）：1472-1474.

［8］ 汤少鹏.TPX2 siRNA对食管鳞癌EC1细胞增殖、凋亡和侵袭的影响［J］.中国实用医刊，2014，7（20）：63-66.

［9］ 高存祥，王勤章，丁国富，等.T1b期肾癌及癌旁组织中PCNA、Bax 的表达及意义［J］.山东医药，2013，53（17）：7-8.

Study on the Mechanism of TPX2 Gene in Pathological Process and Radiotherapy of Breast Cancer

Huang Chaoyou Wu Dehua Han Zheng Zhu Shanshan
（Southern Medical University，Baiyun 510515，China）

ObjectiveTo study the effects and mechanism of TPX22 gene in the pathological process and radiotherapy of breast cancer.Methods The nude-mouse transplanted tumor models of breast tumor stem cells were established.According to whether or not to accept cell radiation intervention，they were divided into intervention group and non-intervention group.The expression levels of TPX22 gene protein in both groups were detected by immunohistochemical method，and the expression of TPX2 related target genes （Bcl-2，Bax，p21 and p53）in breast cancer tissues was detected.The correlation between TPX2 and related target genes was analyzed.Results There was significant growth of transplantation tumor under right axilla of the two groups，and the boundaries between tumor tissues and normal tissues were clear.There were a large number of tumor cells which were in diffuse distribution，with irregular shape.After radiotherapy，the positive rate of TPX2 in the intervention group was 50%while in the non-intervention group was 87.5%.TPX2 was significantly positively correlated with expression level of Bcl-2（RBcl-2=0.9688），while it was significantly negatively correlated with Bax，p21 and p53（RBax=-0.9675，Rp21=-0.9563，RP53=-0.9742）.Conclusion TPX2 is highly expressed in breast cancer cells.It may be involved in the progression of the disease by modulating the expression of Bcl-2，Bax，p21，p53 and other related target genes，affecting the effect of radiotherapy.TPX2 is expected to become a new target for treatment of breast cancer.

TPX2 gene；Breast cancer；Pathological process；Radiotherapy；Mechanism

R737.9

A 学科分类代码： 32067

1001-8131（2017）04-0308-02

2016-12-29

广东省医学科研基金（A2015033）