儿童碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌耐药机制及同源性相关分析

赵鹤进，宋晓光

（1．河南省鹤壁市人民医院，河南 鹤壁 458030；2．河南省鹤壁职业技术学院，河南 鹤壁 458030）

论著

儿童碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌耐药机制及同源性相关分析

赵鹤进1，宋晓光2

（1．河南省鹤壁市人民医院，河南 鹤壁 458030；2．河南省鹤壁职业技术学院，河南 鹤壁 458030）

目的：探讨儿童碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌耐药机制及同源性。方法：收集2014年1月－2016年2月从小儿肺炎患者中分离的8株碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌，采用VITEK-32全自动细菌分析仪进行药敏分析，改良Hodge试验检测碳青霉烯酶，PCR扩增耐药基因，脉冲场凝胶电泳进行同源性分析。结果：药敏试验结果显示菌株对多黏菌素、阿米卡星、庆大霉素的耐药率较低，分别为0，12.50%和25.00%；对美罗培南、厄他培南、头孢噻肟、阿莫西林、头孢他啶、头孢吡肟、头孢西丁、环丙沙星和氨苄西林的耐药率最高，均为100.00%；改良Hodge试验显示8株菌株均为阳性；所有菌株均携带blaNDM-1、blaCMY-6或blaDHA-1基因；8株实验菌分别属于6个不同克隆。结论：儿童耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌应根据药敏试验结果，选择合理药物治疗，携带碳青霉烯酶基因是肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯类抗菌药的原因；耐碳青霉烯酶类肺炎克雷伯菌存在多个克隆，分布较分散。

碳青霉烯类；肺炎克雷伯菌；耐药机制；同源性；儿童

小儿肺炎是婴幼儿多发疾病之一，也是婴幼儿死亡的重要原因。肺炎克雷伯菌是本病重要的致病菌，发病患儿临床症状除了烦躁、拒食、寒战、腹泻、咳嗽等一般症状外，还出现胸膜、心包受累，引起组织坏死、液化、脓肿等，严重影响患儿生命健康[1]。碳青霉烯酶类药物具有极高的广谱β-内酰胺抗菌能力，对肺炎克雷伯菌具有较高杀菌能力[2]。但随着抗菌药的大规模使用，耐碳青霉烯酶类肺炎克雷伯菌感染案例日益增多，临床对这一问题的关注程度也越高[3]。为探究儿童耐碳青霉烯酶类肺炎克雷伯菌耐药机制及同源性，本文收集2014年1月－2016年2月从小儿肺炎患者中分离的碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌进行研究，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

收集2014年1月－2016年2月从小儿肺炎患者中分离的菌株，经VITEK-32全自动细菌分析仪鉴定为肺炎克雷伯菌，采用纸片琼脂扩散法（K-B法）药敏试验证实为耐碳青霉烯酶类肺炎克雷伯菌，共计8株（剔除同一患者相同部位重复分离株），其中痰液5株，血液2株和尿液1株。

1.2 仪器和试剂

VITEK-32型全自动微生物分析仪（Bio-merieux公司）；MG48G型PCR仪（杭州朗基科学仪器有限公司）；GelDoc EQ型凝胶成像系统（Bio-Rad公司）；PCR实验过程试剂、电泳用DNA Marker（北京天根生化科技有限公司）；PCR引物（上海捷瑞生物工程有限公司）。限制性内切酶XbaⅠ、蛋白酶K（上海生工生物工程有限公司）。

1.3 检测方法

1.3.1 药敏试验菌株常规复苏后，选用VITEK-32型全自动微生物分析仪进行鉴定，并选用K-B法进行药敏试验，同时参照2012年美国临床实验室标准化协会（CLSI）文件中的M100-S22条款进行解读[4]。

1.3.2 改良Hodge试验将ATCC25922大肠埃希菌浓度设置为0.5麦氏单位，并15倍稀释，而后涂抹于平皿内，皿中间贴有10 µg/片美罗培南纸，将样本菌株由纸边角向纸张内扩散，室温孵化12 h，美罗培南抑菌圈内凹者提示为试验阳性，即菌株产碳青霉烯酶。

1.3.3 耐药基因PCR检测菌株样本复苏后，接至100 µL无菌蒸馏水内，离心，将上清转移至玻璃管内，冷藏备用。所有分类PCR反应体系均相同，20 µL PCR反应体系内含有正向、反向以及DNA模板，反应参数为：94℃ 5 min，94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，共30循环，72℃延伸10 min。将PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，并选用凝胶成像仪进行结果分析，同时根据BLAST与GenBank的已知序列进行对比。

1.3.4 脉冲场凝胶电泳将1.5 mL细胞悬浊液滴入试管内，对应标记名称，对接种环进行CSB浸润，取4.0麦氏单位新鲜培养细菌滴入试管内。每管滴入15 µL 20 mg/mL的蛋白酶K，混匀，56℃水浴，滴入400 µL的1% Seakem Gold琼脂糖粉，混匀，将混合倒入模具内，去除气泡，室温下凝固20 min。将5 mL细胞裂解液滴入含25 µL蛋白酶K的试管内，混匀备用。削去凝胶多余胶体，保证表面齐整，将胶块放入含细胞裂解液的试管内，保证胶块至于液体内，而不是附着于试管壁，54℃水浴孵化2 h，加入15 mL经预热的TE（Tris和EDTA混合液），50℃水浴10 min，去掉TE，重复3次，加入150 µL缓冲液H的稀释液，加入1.5 mL酶切缓冲液，37℃水浴10 min，电泳，参数为：14℃，6 V/cm，120°角，溴化乙锭染色30 min，紫外线投射凝胶成像观察结果[5]。

2 结果

2.1 药物敏感性结果

药敏结果显示：对多黏菌素、阿米卡星、庆大霉素的耐药率较低，分别为0，12.50%和25.00%；对美罗培南、厄他培南、头孢噻肟、阿莫西林、头孢他啶、头孢吡肟和头孢西丁、环丙沙星、氨苄西林的耐药率最高，均为100.00%。见表1。

表1 8株分离菌药敏试验结果

2.2 改良Hodge试验

对8株耐碳青霉烯酶类肺炎克雷伯菌进行改良Hodge试验，结果均为阳性，提示产碳青霉烯酶。见图1。

2.3 耐药基因检测

经PCR扩增检测和测序比对确认，1～4号菌株均携带blaNDM-1、blaCMY-6和blaDHA-1基因，5号菌株携带blaNDM-1和blaDHA-1基因，6～7号菌株携带blaCMY-6和blaDHA-1基因，8号菌株携带blaNDM-1和blaCMY-6基因。见表2，图2。

2.4 脉冲场凝胶电泳结果

根据脉冲场凝胶电泳结果，8株共分为A、B、C、D、E和F群，C和D克隆群分别有2株，A、B、E和F克隆群各1株。见图3。

图1 部分菌株检测结果

表2 耐药基因检测

图2blaNDM-1、blaCMY-6和blaDHA-1基因PCR扩增产物电泳图

图3 8株PFGE聚类分析结果

3 讨论

肺炎克雷伯菌是革兰阴性杆菌，主要存在于人呼吸道及肠道内，当人体因各种因素出现抵抗力降低时，肺炎克雷伯菌就会经呼吸道进入肺部，并诱发大叶或小叶融合性实变，最终引发肺炎等一系列症状[6]。及早给予抗菌药是肺炎克雷伯菌感染治疗的核心内容，常用的抗菌药有碳青霉烯类、氨基苷类以及头孢菌素等。

碳青霉烯类抗菌药作为广谱β-内酰胺抗菌药，具有较高的酶稳定性，为临床广泛应用的小儿肺炎治疗药物[7]。在抗菌药滥用日益严重的今天，肺炎克雷伯菌等菌属对碳青霉烯类抗菌药耐药的报道日益增多，并逐年上升[8]。本次研究中药敏试验结果显示菌株对多黏菌素、阿米卡星、庆大霉素的耐药率较低，分别为0，12.50%和25.00%；对美罗培南、厄他培南、头孢噻肟、阿莫西林、头孢他啶、头孢吡肟、头孢西丁、环丙沙星和氨苄西林的耐药率最高，均为100.00%，提示在碳青霉烯酶类肺炎克雷伯菌小儿肺炎治疗工作中，美罗培南、厄他培南等药物需谨慎使用，推荐使用多黏菌素。碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的多重耐药特征与其合成的超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）以及AmpC β-内酰胺酶合成能力有关，其中ESBLs具有的质粒介导能力，对第三、四代头孢类抗菌药具有水解能力，而AmpC酶则可水解β-内酰胺，这使得碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌具有更为复杂的耐药表型[9]。本次研究中，改良Hodge试验显示8株菌株均为阳性，这也证明肺炎克雷伯菌具有碳青霉烯类耐药特征。改良Hodge试验是实验室标准化协会（CLIS）公认的碳青霉烯酶表型检测方式[10]。

已有研究证明，产碳青霉烯酶是碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌耐药的重要机制，该酶具有A、D类丝氨酸碳青霉烯酶以及B类金属β-内酰胺酶3种分型，其中A类分型是主要的碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌耐药诱因[11]。本次研究中，8株耐碳青霉烯酶类肺炎克雷伯菌携带的基因为blaNDM-1、blaCMY-6和blaDHA-1基因，这表明blaNDM-1、blaCMY-6或blaDHA-1基因与碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌耐药存在密切相关。国内最早的blaNDM-1基因携带耐药菌为鲍曼不动杆菌，该金属酶具有较强水解活性，并且其基因编码位于质粒，这使得本基因可在细菌间进行广泛复制、传播[12]。blaCMY-6基因是肠杆菌科细菌携带的最广的耐药基因，在阴沟肠杆菌、枸橼酸杆菌等耐药菌内均有发现[13-14]。blaDHA-1基因携带菌除具有β-内酰胺类抗菌药的敏感性，并对其他β-内酰胺类抗菌药也存在耐药，如头霉素类、硫霉素类β-内酰胺类抗菌药[15]。此外，本研究还发现8株试验菌分别属于6个不同克隆，这表明碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌耐药机制极其复杂，分布较散乱，涉及基因较多，临床抗感染治疗难度面临巨大挑战。

本研究通过改良Hodge试验、耐药基因PCR检测以及脉冲场凝胶电泳等试验对耐碳青霉烯酶类肺炎克雷伯菌的作用机制及同源性进行初步的分析，研究具有可信性。但已有研究证明耐碳青霉烯酶类肺炎克雷伯菌具有地区基因多态性，这可能是本研究的不足之处，这需要下一步的大范围菌株研究。

综上所述，耐碳青霉烯酶类肺炎克雷伯菌小儿肺炎推荐药物可选多黏菌素，携带碳青霉烯酶基因是肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯类抗生素的原因；耐碳青霉烯酶类肺炎克雷伯菌存在多个克隆，分布较分散，临床应根据药敏结果，选择合理药物治疗。

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本文编辑：鲁守琴

Resistance Mechanism and Homology Analysis of Carbapenem Resistant Klebsiella pneumoniae in Children

Zhao He-jin1, Song Xiao-guang2
(1. The People’s Hospital of Hebi City , Henan Province, Henan Hebi 458030,China；2 . Hebi Vocational and Technical College ， Henan Province，Henan Hebi 458030,China)

Objective：To investigate the resistance mechanism and homology of carbapenem resistantKlebsiella pneumoniaein children.Methods：8 strains of carbapenem resistantKlebsiella pneumoniawas isolated from children with pneumonia from January 2014 to February 2016, VITEK-32 automatic bacterial analyzer was used for drug sensitivity analysis, modified Hodge assay was used to detect carbapenems and PCR amplification was used to amplify resistance genes, and homology analysis was carried out by pulsed field gel electrophoresis.Results：The drug sensitivity test showed that the resistance rate of the strains to polymyxin, amikacin and gentamicin was 0, 12.50%and 25.00%; the resistant rates of meropenem, ertapenem, cefotaxime, amoxicillin, ceftazidime, cefepime, cefoxitin,ciprofloxacin and mpicillin were highest that all reached 100.00%. The modified Hodge test showed that all 8 strains were positive; all strains carried blaNDM-1, blaCMY-6 or blaDHA-1 gene, and 8 strains belonged to 6 different clones.Conclusion：The carbapenem resistantKlebsiella pneumoniaof children should base on the results of drug sensitivity to use reasonable medication. The carbapenem gene is the cause of carbapenem resistance inKlebsiella pneumonia.There are several clones of carbapenem resistantKlebsiella pneumoniae, and the distribution is dispersed.

Carbapenemases;Klebsiella pneumoniae; Resistance Mechanism; Homology; Children

R446.5

A

10.3969/j.issn.2096-3327.2017.08.001

2017 - 05 - 22

赵鹤进，男，副主任技师。研究方向：微生物免疫专业。E-mail：383670116@qq.com

宋晓光，男，主管技师（讲师）。研究方向：临床检验技术。E-mail：99320729@qq.com