核桃楸丙酮提取物的稳定性及抑菌活性

王天淼，孙墨珑

(东北林业大学 理学院，哈尔滨 150040)

核桃楸丙酮提取物的稳定性及抑菌活性

王天淼，孙墨珑*

(东北林业大学 理学院，哈尔滨 150040)

采用超声法和紫外分光光度法提取和测定核桃楸叶和外果皮丙酮提取物的单宁含量，以单宁降解率作为评价指标，考察温度和光照等因素对核桃楸叶和外果皮丙酮提取物稳定性的影响。结果表明：以体积分数50%丙酮-水溶液为浸提液，超声温度50 ℃，超声时间40 min，料液比1∶15，超声波提取核桃楸叶和外果皮单宁含量分别为38.6 mg/g和35.4 mg/g。随着温度升高或强光照射，核桃楸丙酮提取物中的单宁降解率增加，稳定性降低。核桃楸叶丙酮提取物的稳定性略高于外果皮丙酮提取物。同时采用牛津杯法研究核桃楸叶和外果皮丙酮提取物对木材腐朽菌的抑菌效果。结果表明：核桃楸叶和外果皮丙酮提取物对木材褐腐菌密粘褶菌和白腐菌彩绒革盖菌均有抑菌活性。核桃楸叶和外果皮丙酮提取物对密粘褶菌的最低抑菌质量浓度(MIC)均为1.50 g/L，对彩绒革盖菌的MIC均为2.00 g/L。核桃楸丙酮提取物对密粘褶菌的抑菌活性略优于彩绒革盖菌。核桃楸叶和外果皮丙酮提取物适合于中性条件下室温避光贮存和使用。

核桃楸；稳定性；抑菌活性；提取；单宁

0 引言

核桃楸(JuglansMandshuricaMaxim.)，为胡桃科胡桃属落叶乔木，主要分布于我国东北地区(小兴安岭及张广才岭)，是东北阔叶红松林重要的伴生树种，也是重要的药源植物。对具有生物活性成分的木本药源植物进行研究与利用，具有广阔的研究空间和应用前景。核桃楸外果皮中含有单宁、胡桃醌、α-和β-氢化胡桃叶醌等，叶片中的主要成分为没食子酸、胡桃叶醌和多酚复合物等[1-2]。胡桃醌是核桃楸中主要的毒性物质，相对含量较高[3]。植物单宁，又称植物多酚，是一类广泛存在于植物体内的天然多酚类物质。许多植物的叶、树皮和种皮等部位中都含有丰富的单宁，其独特的化学性质源于自身的多酚羟基结构[4-5]。植物提取物中的活性成分是植物的一类或几类次生代谢物质，植物提取物的稳定性受温度和光照等因素的影响[5]。目前对核桃楸的研究主要关于外果皮、叶、树皮中化学成分、胡桃醌及总黄酮含量、乙醇提取物的抑菌和杀虫活性等方面[7-16]。关于核桃楸丙酮提取物的稳定性及其抑菌活性未见报道。本研究采用超声波提取核桃楸叶和外果皮中的单宁。以单宁降解率作为评价指标，考察温度和光照等因素对核桃楸叶和外果皮丙酮提取物稳定性的影响，考察丙酮提取物对木材腐朽菌的抑菌活性，以期为核桃楸叶和外果皮的研究与利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试验用的核桃楸叶和外果皮样品采于东北林业大学实验林场。木材褐腐菌密粘褶菌(Gloeophyllumtrabeum)和白腐菌彩绒革盖菌(Coriolusversicolor)来自东北林业大学工程技术学院试验室。试剂：单宁酸标准品(美国SIGMA公司)；其他试剂均为分析纯。仪器：TU-1901紫外分光光度计；KQ3200DE数控超声波振荡仪；YXQ-LS-30SII高温蒸汽灭菌锅；HSX-450恒温恒湿培养箱。

1.2 试验方法

1.2.1 单宁酸标准曲线绘制

单宁含量测定方法采用磷钼酸-磷钨酸比色法(F-D法)进行测定[17]。精确配制0.100 g/L单宁酸标准溶液待用。分别量取单宁酸标准溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于5个干燥的容量瓶中，分别加入F-D试剂2 mL，饱和Na2CO3溶液10 mL，定容50 mL。放置30 min显色，用紫外分光光度计测定654 nm处的吸光度。以吸光度值与标样浓度的关系建立单宁标准曲线。

1.2.2 核桃楸叶和外果皮丙酮提取物中单宁的含量测定

称取核桃楸叶和外果皮粗粉各2.00 g，以体积分数50%的丙酮-水溶液为浸提液，在超声温度50 ℃，超声时间40 min，料液比1∶15的条件下提取核桃楸样品。收集3次浸提液，定容至100 mL。分别量取核桃楸叶和外果皮的单宁提取液1.0 mL，参照单宁标准溶液的测定方法测定溶液吸光度。

1.2.3 温度和光照影响核桃楸叶和外果皮丙酮提取物稳定性的测定方法

将浓度为20.0 g/L的核桃楸叶和外果皮50%丙酮-水溶液提取液置于7个系列50 mL容量瓶中，每系列设2组平行样，参照单宁标准溶液的测定方法测定各溶液的吸光度。然后蜡封，5个系列分别置于15、25、35、45、55℃恒温条件下放置，2个系列分别置于4 000 Lx强度的光照下(各每天光照8 h)放置。3、6、9、14 、21 d后测定各溶液的吸光度，每系列取平均值，计算单宁含量[18]。以单宁降解率作为指标，考察温度和光照对核桃楸叶和外果皮丙酮提取物稳定性的影响。单宁降解率计算公式为：

(1)

1.2.4 核桃楸丙酮提取物的抑菌活性测定

采用牛津杯法测定核桃楸叶和外果皮丙酮提取物的抑菌效果[19]。将已灭菌的马铃薯琼脂培养基(PDA)10 mL熔化倒入培养皿中，待冷却凝固后，每皿对称打入4只灭菌牛津杯(直径为7.9±0.1 mm)，倒入含有菌液的PDA，至培养基高度恰好与牛津杯上端持平，凝固后用镊子轻轻取出牛津杯。在牛津杯留下的空洞里分别注入0.50～3.00 g/L共6个浓度的丙酮提取液1 mL，丙酮溶剂作空白，密封后放入恒温培养箱中培养7d观察。

2 结果与讨论

2.1 核桃楸叶和外果皮丙酮提取物中单宁的含量

参照单宁标准曲线，核桃楸叶和外果皮50%丙酮-水溶液提取物的单宁含量分别为38.6 mg/g和35.4 mg/g。

2.2温度对核桃楸叶和外果皮丙酮提取物稳定性的影响

温度对核桃楸叶和外果皮丙酮提取物稳定性的影响见表1。

表1 温度对核桃楸丙酮提取物稳定性的影响

由表1可以看出，随着温度升高，核桃楸叶和外果皮丙酮提取物中的单宁降解率增大，稳定性降低。55℃放置21 d时，单宁降解率高于20%，稳定性差。不同温度时，单宁降解率与放置时间均呈对数关系，具有一级反应的特征[18]。稳定性回归分析表明，温度为55℃时，核桃楸叶和外果皮丙酮提取物单宁降解率达到50%时所需时间分别为53.4 d和49.6 d。

2.3光照对核桃楸叶和外果皮丙酮提取物稳定性的影响

光照对核桃楸叶和外果皮丙酮提取物稳定性的影响见表2。

表2 光照对核桃楸丙酮提取物稳定性的影响

由表2可以看出，强光照射时间越长，核桃楸叶和外果皮丙酮提取物中的单宁降解率增大，稳定性降低。强光照射放置21 d时，单宁降解率高于20%，稳定性差。强光照射时，单宁降解率与放置时间均呈线性关系，具有零级反应的特征[18]。稳定性回归分析表明，核桃楸叶和外果皮丙酮提取物单宁降解率达到50%时所需时间分别为43.6 d和38.7 d。

2.4 核桃楸叶和外果皮丙酮提取物的稳定性比较

55℃和强光照射时，核桃楸叶和外果皮丙酮提取物的稳定性比较如图1所示。

图1 55℃和强光照射时核桃楸丙酮提取物 的稳定性比较Fig.1 Stability comparison of the acetone extracts on Juglans mandshurica at 55℃ and with sunshine

由图1可以看出，核桃楸叶丙酮提取物的稳定性略高于外果皮丙酮提取物。核桃楸叶和外果皮丙酮提取物适合于中性条件下室温避光贮存和使用。

2.5 核桃楸丙酮提取物的抑菌活性测定结果

核桃楸叶和外果皮丙酮提取物对木材褐腐菌密粘褶菌和白腐菌彩绒革盖菌的抑菌活性测定结果见表3。

表3 核桃楸丙酮提取物抑菌活性测定结果

由表3可以看出，核桃楸叶和外果皮丙酮提取物对木材褐腐菌密粘褶菌和白腐菌彩绒革盖菌均有抑菌活性。核桃楸叶和外果皮丙酮提取物对密粘褶菌的最低抑菌质量浓度(MIC)均为1.50 g/L，对彩绒革盖菌的MIC均为2.00 g/L。核桃楸丙酮提取物对密粘褶菌的抑菌活性略优于彩绒革盖菌。

多酚类物质容易发生氧化或降解，而且在植物体内常与黄酮类、醌类、简单酚和木质素等以化学键结合共存。不同植物以及同种植物不同器官中的单宁，因其化学结构不同使得其用途也各不相同。核桃楸单宁为水解类单宁，是由酸及其衍生物与葡萄糖或多元醇主要通过酯键形成的化合物，其容易被酸(或酶)水解为糖、多元醇和酚性羧酸[4]。

单宁分子中大量的酚羟基和芳香环结构可以与酶的肽基、氨基及羧基等以氢键的形式发生多点结合，抑制微生物酶的活性，对微生物膜造成一定的损伤[20-21]。由于植物单宁存在着化学性质极为相似的同系物，化学结构复杂多样，且单宁的异质性随着其聚合度的增大而增加，使得植物单宁聚合物的分离和结构分析有待进一步研究。

3 结论与讨论

超声波提取核桃楸叶和外果皮单宁含量分别为38.6 mg/g和35.4 mg/g。随着温度升高，核桃楸叶和外果皮丙酮提取物中的单宁降解率增大，稳定性降低。55℃放置21 d时，单宁降解率高于20%，稳定性差。不同温度时，单宁降解率与放置时间均呈对数关系，具有一级反应的特征。通过稳定性回归分析，温度为55℃时，核桃楸叶和外果皮丙酮提取物单宁降解率达到50%时所需时间分别为53.4 d和49.6 d。强光照射时间越长，核桃楸叶和外果皮丙酮提取物中的单宁降解率增大，稳定性降低。强光照射放置21 d时，单宁降解率高于20%，稳定性差。强光照射时，单宁降解率与放置时间均呈线性关系，具有零级反应的特征。通过稳定性回归分析，核桃楸叶和外果皮丙酮提取物单宁降解率达到50%时所需时间分别为43.6 d和38.7 d。核桃楸叶丙酮提取物的稳定性略高于外果皮丙酮提取物。核桃楸丙酮提取物对木材褐腐菌密粘褶菌和白腐菌彩绒革盖菌均有抑菌活性。核桃楸叶和外果皮丙酮提取物对密粘褶菌的最低抑菌质量浓度(MIC)均为1.50 g/L，对彩绒革盖菌的MIC均为2.00 g/L。核桃楸丙酮提取物对密粘褶菌的抑菌活性略优于彩绒革盖菌。核桃楸叶和外果皮丙酮提取物适合于中性条件下室温避光贮存和使用。植物单宁聚合物的分离和结构分析有待进一步研究。

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StabilityandAntifungalActivitiesofAcetoneExtractsonJuglansmandshurica

Wang Tianmiao，Sun Molong*

(College of Science，Northeast Forestry University，Harbin 150040)

In order to investigate the stability and antifungal activities of acetone extracts on Juglans mandshurica，ultrasonic and UV spectrophotometry method were used to extract and determine the tannins content of acetone extracts on leaves and green peel of Juglans mandshurica.Taking the tannin degradation rate as the evaluation index，the effects of temperature and sunshine on the stability of acetone extracts were studied.Results showed that the optimal extraction conditions were the volume fraction of acetone 50% with water，ultrasonic temperature of 50 ℃，extraction time of 40 min，solid-liquid ratio of 1∶15，the tannins contents were 38.6 mg·g-1and 35.4 mg·g-1with leaves and green peel of Juglans mandshurica respectively.With the increase of temperature or strong sunshine，the degradation rate of tannin increased and the stability decreased.The stability of acetone extract of leaves was slightly higher than that of green peel.The cylinder-plate method was used to evaluate the antifungal effect for wood-rooting fungi of the acetone extracts on leaves and green peel of Juglans mandshurica.Results showed that acetone extracts of Juglans mandshurica had antifungal activities for wood-rotting fungi of both Gloeophyllum trabeum and Coriolus versicolor.MIC of the acetone extracts on leaves and green peel of Juglans mandshurica were both 1.50 g/L for Gloeophyllum trabeum，and both 2.00g/L for Coriolus versicolor.The antifungal activity for Gloeophyllum trabeum was better than that for Coriolus versicolor.The acetone extracts on leaves and green peel of Juglans mandshurica are suitable storage and use for neutral condition at room temperature and away from light.

Juglansmandshurica；stability；antifungal activities；extraction；tannins

S 792；Q 946

：A

：1001-005X(2017)05-0041-04

2017-05-29

中央高校基本科研业务费专项资金项目(2572015BB18)

王天淼，硕士，助理工程师。研究方向：天然产物化学。tmwang@nefu.edu.cn

孙墨珑，博士，教授。研究方向：天然产物化学。E-mail：molongsun@126.com

王天淼，孙墨珑.核桃楸丙酮提取物的稳定性及抑菌活性[J].森林工程，2017，33(5)：41-44.