急性淋巴细胞白血病患儿亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)C677T多态性与甲氨蝶呤毒性相关性的Meta分析

朱 忱，王晓玲，李晓玲

急性淋巴细胞白血病患儿亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)C677T多态性与甲氨蝶呤毒性相关性的Meta分析

朱 忱1，2，王晓玲3，李晓玲2*

目的探讨急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿中亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因 C677T 位点的多态性与甲氨蝶呤(MTX)毒副反应的相关性。方法通过检索PubMed、Cochrane Library、Web of Science、Embase等数据库，收集建库至2016年8月1日关于ALL患儿MTHFR C677T位点的多态性与MTX毒副反应的观察性队列研究，并提取基因型、MTX毒性相关资料进行方法学质量评价，采用RevMan 5.3软件进行Meta分析。结果共纳入9篇文献进行 Meta分析，结果显示，MTHFR C677T多态性与肝毒性(如：CC vs. CT/TT，RR：0.81，95%CI：0.65～1.00，P=0.05)、血液毒性、黏膜毒性均不存在显著相关性。但单个研究显示，非洲人群在肝毒性、血液毒性、黏膜毒性(如：CC/CT vs. TT，RR：0.10，95%CI：0.03～0.39，P=0.000 9)方面，677C 等位基因相对于其他人种而言具有较明显的保护作用。结论在ALL患儿中，MTHFR C677T不是一个好的预测MTX毒性的指标，两者的关系尚需要大样本量、高质量的研究来进一步验证。

儿童；急性淋巴细胞白血病；亚甲基四氢叶酸还原酶；C677T；多态性；甲氨蝶呤；毒性

0 引言

急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia，ALL)是儿童最常见的一种恶性肿瘤，在儿童恶性肿瘤中约占30%[1]。甲氨蝶呤(MTX)是治疗儿童ALL化疗方案中重要的组成成分，在临床治疗上取得了很好的效果，但是MTX治疗过程中所产生的相关毒性反应成为临床的一个巨大的挑战[2]，包括黏膜毒性、肝毒性、血液毒性、神经毒性等。因此，寻找一个能预测MTX毒性的指标尤为重要[3]。研究发现，在MTX代谢通路中，叶酸代谢调节基因的多态性会对MTX的药代动力学产生影响[4]，从而影响其疗效及不良反应。而其中的亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)则由于其在细胞内叶酸稳态及代谢方面的重要性[5]，成为许多药物基因组学研究的焦点。MTHFR基因的2个常见多态是C677T (rs1801133) 和A1298C (rs1801131)[6]，国内外学者对MTHFR C677T位点的多态性与MTX的毒副反应关系的研究较多，但结论存在争议[7-8]。本文就这一存在争论的问题，收集国内外近十年来报道的相关文献，纳入所有人种，进行Meta分析，探讨ALL患儿中MTHFR基因C677T位点的多态性与MTX毒副反应的相关性。

1 材料与方法

1.1 检索策略 以methotrexate、methylenetetrahydrofolate reductase、MTHFR、gene、polymorphism、hematological malignancy、acute lymphoblastic leukemia、ALL、pediatric、children等为关键词，两位研究者独立检索PubMed、Cochrane Library、Web of Science、Embase等数据库。检索时间：建库至2016年8月1日，语言限制：英语，研究类型不限。手动检索ClinicalTrials.gov及纳入文献的参考文献。

1.2 研究纳入标准 两名研究者分别独立评价文献相关性，纳入评价 MTHFR C677T 基因多态性与MTX毒副作用相关性的研究，限定人群为ALL患儿，种族不限。且提供充足的基因型对应毒性发生情况的二分类变量数据，从而可计算风险比(RR)及95%置信区间(95%CI)。当同一组样本研究出现在多个文献中，只选取最近发表的文献。如对文献纳入出现分歧，两位研究者通过协商达成一致。

1.3 数据提取 两位研究者独立从纳入的文章中提取相关数据，包括：作者、发表时间、种族或国家、患者数量、疾病、年龄、性别、治疗方案、MTX剂量、基因型、甲氨蝶呤毒副作用、是否符合遗传平衡定律(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)及毒副作用分级标准。若纳入文献中相关数据缺失，则通过电话或邮件的形式联系其通讯作者获取数据。在数据提取过程中若出现意见分歧，则寻求第3名研究者帮助，并且意见达成一致。

1.4 质量评价 两名研究者背对背独立参照Newcastle-Ottawa Quality Assessment Scale (NOS)对纳入文献进行质量评价，意见不一致处可通过讨论或第3名研究者介入评判，达成共识。

1.5 数据合并与分析 若纳入文献中有2篇或2篇以上文献报道同一种毒性反应且没有明显异质性，则合并其数据并采用Cochrane协作网提供的RevMan 5.3软件进行Meta分析。数据统计使用分层分析方法(Mantel-Haenszel方法)计算RR值及95%CI。用Q检验及I2评价异质性大小，当I2≥50%，表明有中度到重度的异质性，选择随机效应模型，反之选择固定效应模型。用Z检验来计算RR值是否有统计学意义(P<0.05)。同时，采用显性模型(CC vs. CT/CT)、隐形模型(CC/CT vs. TT)及纯合子模型(CC vs.TT)分别计算RR值。本次Meta分析主要关注基因型与非血液毒性(肝毒性和黏膜毒性)及血液毒性之间的联系。若数据合并后存在异质性，即按人种(高加索人、亚洲人和非洲人)进行亚组分析，并通过剔除NOS评分较低的研究对结果进行敏感性分析，检验结果的稳定性。最后，使用Stata 12.0进行Egger检验，观察其是否存在发表偏移。

2 结果

2.1 纳入文献特点 文献筛选流程图见图1。按上述检索方法共检索到1 082篇文献，排除520篇重复文献，之后阅读标题和摘要，最终筛选出125篇文献并查找全文，通读文献后评价其是否符合纳入标准。最终排除116篇，包括：26篇会议摘要(无法获取全文)；4篇给编辑的信；34篇样本人群为成人和儿童；23篇基因型对应毒性数据不全；25篇数据为连续变量形式；4篇研究数据重复。最后，共有9篇文献符合标准，纳入本次Meta分析，见表1。在这9个研究中，MTX剂量范围为 2～5 g/m2。人种涉及高加索人(5篇)、亚洲人(1篇)、非洲人(1篇)及混合人种(2篇)。

图1 MTHFR C677T 多态性与ALL患儿甲氨蝶呤毒性相关性的Meta分析文献纳入流程图

2.2 文献质量 9篇文献均为观察性的队列研究。其中6分1篇，7分5篇，8分1篇，9分2篇。见表1。

2.3 在ALL患儿中MTHFR C677T 基因多态性与甲氨蝶呤相关毒性的关系 对不同毒性分别按显性模型、隐性模型及纯合子模型进行分析。见表2。

表1 纳入9篇MTHFR C677T多态性与ALL患儿的甲氨蝶呤毒性相关性文献的研究特征

注：—为文中未提及，√为文中提及；MTX：甲氨蝶呤；ADR：不良反应；NCI-CTCAE：美国国家癌症研究所不良事件分级标准；NOS：Newcastle-Ottawa Quality Assessment Scale

表2 纳入9篇MTHFR C677T多态性与ALL患儿的甲氨蝶呤毒性相关性文献的合并分析结果

注：#存在较大异质性，进行异质性来源分析；*P<0.05

如表2所示，共有4个研究(总样本量为833例)提到肝毒性(≥2级)，合并后未发现与 MTHFR C677T 基因的显著关系(如：CC vs. CT/TT，RR：0.81，95%CI：0.65～1.00，P=0.05)。见图2。在隐性模型和纯合子模型中发现了较大异质性(CC/CT vs. TT，I2=84%；CC vs. TT，I2=74%)，按人种分为亚洲人、非洲人和混合人种，分别进行分析，发现仅在非洲人群的研究中，MTHFR C677T与肝毒性存在显著关联性(CC/CT vs. TT，RR：0.05，95%CI：0.01～0.33，P=0.002；CC vs. TT，RR：0.09，95%CI：0.01～0.58，P=0.01)。

共有8个研究涉及血液毒性，根据各研究数据统计特点，可划分为1～4级和3～4级。然而，合并后没有发现与C677T基因的相关性(图2)。另外，3～4级血液毒性合并后，存在较大异质性(CC vs. CT/TT，I2=80%；CC/CT vs. TT，I2=83%；CC vs. TT，I2=78%)。考虑到种族的差异及纳入研究数量有限，将显性模型组按种族进行亚组分析，单纯对高加索人进行合并，但异质性仍然存在(I2=84%)。在隐性模型和纯合子模型中，按人种分别对各研究进行分析，发现 677C 等位基因在非洲人群中有保护作用(CC/CT vs. TT，RR：0.30，95%CI：0.13～0.71，P=0.006；CC vs. TT，RR：0.22，95%CI：0.06～0.84，P=0.03)，而在高加索人群中却增加血液毒性发生风险(CC/CT vs. TT，RR：2.69，95%CI：1.04～6.96，P=0.04；CC vs. TT，RR：2.83，95%CI：1.05～7.65，P=0.04)。

针对黏膜毒性，将其分为1～4级和≥3级进行统计分析，结果显示，1～4级黏膜毒性在各模型中均不存在显著关联性(图2)，而≥3级的黏膜毒性只有1项研究报道，但该研究显示 677C 等位基因在非洲人群中具有黏膜保护作用(CC vs. CT/TT，RR：0.15，95%CI：0.02～1.01，P=0.05；CC/CT vs. TT，RR：0.10，95%CI：0.03～0.39，P=0.000 9；CC vs. TT，RR：0.09，95%CI：0.01～0.63，P=0.01)。

2.4 异质性和敏感性分析 在本次Meta分析中，一些毒性数据合并存在异质性，因此，选择随机效应模型并进行亚组分析，寻找异质性来源。在按人种进行亚组分析后，有的异质性仍然存在，这种异质性可能是由于MTX剂量、毒性分级标准、样本量等因素造成的。同时，我们对I2≥50%的合并结果进行敏感性分析。根据NOS评分结果，剔除得分较低的研究后，所有结果均没有明显改变，表明此次Meta分析结果是稳定的。

2.5 发表偏倚 利用Egger检验定量评价纳入的描述ALL患儿MTHFR C677T多态性与发生肝毒性风险相关性的文献是否存在发表偏倚，结果表明，纳入的研究不存在发表偏倚(P=0.654)。

3 讨论

MTX是一种拮抗叶酸代谢的化疗药物，已经被广泛用于儿童ALL的治疗。尽管已经有许多学者对MTHFR C677T多态性与MTX毒性相关性进行了分析，但仍然没有明确的结论，尤其是在儿童人群中。由于针对儿童患者的单个研究设计不同且缺乏说服力，所以笔者进行Meta分析，旨在为使用MTX治疗的ALL患儿提供一个全面、可靠的MTHFR C677T多态性与毒性相关性的结论。

图2 显性模型(CC vs. CT/TT)下肝毒性(≥G2)、黏膜毒性(G1-4)及血液毒性(G1-4)与MTHFR C677T多态性关系的森林图

纳入研究的数据合并结果显示，MTHFR C677T基因多态性与MTX毒性没有显著相关性，这一结果与2013年Lopez-Lopez等[5]Meta分析结果相似，但2014年Hagleitner等[17]的Meta分析则显示，MTHFR 677T基因突变可增加MTX引起肝毒性的风险。这可能是由于Lopez-Lopez的研究设计与本次设计大体相同，而Hagleitner纳入了骨肉瘤患者，使得治疗方案、MTX剂量、疗程、合并用药间的差异增大，最终导致结果不同。本次纳入的单个研究表明，①在非洲人群中，MTHFR C677T基因多态性与黏膜毒性的增加相关[10](CC vs. CT/TT，RR：0.15，95%CI：0.02～1.01，P=0.05；CC/CT vs. TT，RR：0.10，95%CI：0.03～0.39，P=0.000 9；CC vs. TT，RR：0.09，95%CI：0.01～0.63，P=0.01)；且在隐性模型和纯合子模型中，677C等位基因在肝毒性(≥2级)(CC/CT vs. TT，RR：0.05，95%CI：0.01～0.33，P=0.002；CC vs. TT，RR：0.09，95%CI：0.01～0.58，P=0.01)和血液毒性(3～4级)(CC/CT vs. TT，RR：0.30，95%CI：0.13～0.71，P=0.006；CC vs. TT，RR：0.22，95%CI：0.06～0.84，P=0.03)方面发挥了保护的作用，且较其他人种保护作用更明显。②而高加索人群中[11]，677T突变基因在隐性模型和纯合子模型中，在血液毒性(3～4级)方面存在保护作用。然而，由于本次Meta分析纳入研究数量有限且样本量较小，所以需要进一步的大样本研究来验证不同种族中MTHFR C677T基因多态性与MTX毒性的关系。

在ALL患儿的化疗方案中，MTX的剂量主要采用大剂量(>1 g/m2，与成人有所不同)[18]。本次纳入的研究MTX剂量为2、2.5、5 g/m2，由于剂量相似，且有关剂量对应毒性数据缺乏，所以无法进行亚组分析证明剂量对基因-毒性关系的影响。然而，Zhao等[2]在成人血液恶性肿瘤患者中发现，MTHFR C677T的突变对MTX毒性增加的风险是独立于MTX剂量的。但是仍然缺少相关数据，需要更多新的研究来得到更可靠的结论。

在实际临床实践中，儿童对MTX的反应好于成人[2]。研究显示，ALL患儿较成人有更好的疗效，且5年无事件生存率接近80%，而成人只有40%[1,19]。因此，或许儿童MTHFR C677T的多态性与MTX毒性之间的关系较成人不明显，这可能也是造成本次Meta分析无相关性的一个原因。

本次数据合并过程中存在异质性，且在显性模型的血液毒性(3～4级)中，按人种进行亚组分析仍无法消除其异质性(I2=80%)，于是我们尝试剔除NOS得分最低的研究，发现异质性显著下降(I2=56%)，表明研究的不同质量也是异质性的来源之一。此外，为了使本次分析结果更为保守，对于存在异质性(I2≥50%)的组，我们选择使用随机效应模型。本次研究异质性来源还可能是MTX剂量、疗程、毒性分级标准以及叶酸补充情况。

本研究存在的局限性：①纳入研究的数量及样本量较少；②纳入的人种比例不均衡，高加索人占多数，亚洲人(140例)和非洲人(40例)占比较少，可能影响结果的准确性；③各研究中MTX治疗方案不同，导致疗程不同及合并用药不同，这可能会影响MTX毒性的发生，从而影响基因多态性与毒性之间的关系；④不同研究采用不同的毒性分级标准，虽然各种标准大同小异，但是某些细节上的差异也会影响毒性分级的一致性，从而影响各级毒性的发生人数。因此，需要进一步的多中心、大样本、信息详实的研究来探讨ALL患儿MTHFR C677T多态性与MTX毒性的关系。

4 结论

本次Meta分析表明，在ALL患儿中，MTHFR C677T不是一个好的预测MTX毒性的指标。但由于本次研究纳入文献较少，样本量小，所以仍需要大样本量、高质量的研究来进一步验证。

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AssociationbetweentheC677TpolymorphismsofMTHFRandthetoxicityofmethotrexateinpediatricacutelymphoblasticleukemia:aMeta-analysis

ZHU Chen1,2，WANG Xiao-ling3,LI Xiao-ling2*

(1.Sir Run Run Shaw Hospital,Medical School,Zhejiang University,Hangzhou 310016,China;2.Xuanwu Hospital of Capital Medical University,Beijing 100053,China;3.Beijing Children′s Hospital,Capital Medical University,Beijing 100045,China)

ObjectiveTo systemically analyze the association between the C677T polymorphisms of MTHFR and the toxicity of methotrexate (MTX) in pediatric acute lymphoblastic leukemia (ALL).MethodsThe articles about association between MTHFR C677T polymorphism and MTX-induced toxicity in pediatric ALL were achieved by searching PubMed,Cochrane Library,Web of Science and Embase from the establishment of database to August 2016.The methodology quality was evaluated by extracting related information of genotype and MTX toxicity.RevMan 5.3 software was applied to perform the Meta-analysis.ResultsTotally 9 studies were included.The Meta-analysis results indicated that there was no significant association between MTHFR C677T and hepatotoxicity (CC vs.CT/TT,RR:0.81,95%CI:0.65～1.00,P=0.05),hematologic toxicity and mucositis.However,single study showed that the protective effect of 677C was more obvious in the African on hepatotoxicity,hematologic toxicity and mucositis (CC/CT vs.TT,RR:0.10,95%CI:0.03～0.39,P=0.000 9).ConclusionMTHFR C677T polymorphisms do not seem to be a good marker of MTX-related toxicity in pediatric ALL.Large-sample and high-quality studies are required to verify the conclusions.

Children;ALL;MTHFR;C677T;Polymorphism;MTX;Toxicity

2016-11-29

1.浙江大学医学院附属邵逸夫医院，杭州 310016;2.首都医科大学宣武医院药剂科，北京 100053；3.首都医科大学附属北京儿童医院，北京 100045

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201709007