RNA干扰水通道蛋白4抑制创伤性脑水肿的效果及相关机制

吴川丽 陈国宁 张冠壮 陈兴活

(海南省中医院急诊科，海南 海口 570203)

RNA干扰水通道蛋白4抑制创伤性脑水肿的效果及相关机制

吴川丽 陈国宁 张冠壮1陈兴活1

(海南省中医院急诊科，海南 海口 570203)

目的探究水通道蛋白(AQP)4对创伤性脑水肿(TBE)的抑制效果及相关机制。方法健康雄性Wistar大鼠随机分为治疗组、空质粒组、创伤组和假手术组。治疗组和空质粒组大鼠脑损伤后分别注射AQP4 siRNA质粒和空白质粒，创伤组大鼠脑损伤后无治疗处理，假手术组大鼠假手术后注射生理盐水。于不同时间点检测各组大鼠脑组织含水率、AQP4 mRNA的表达水平和伊凡思蓝(EB)浓度。结果脑损伤后，治疗组、空质粒组和创伤组大鼠脑组织含水率、AQP4 mRNA表达水平和EB浓度均高于假手术组，随时间增加呈上升趋势，48～72 h达到峰值，而假手术组大鼠脑组织含水率、AQP4 mRNA表达水平和EB浓度随时间无明显变化。进一步分析显示AQP4 siRNA治疗组大鼠的脑组织含水率，AQP4 mRNA表达水平和EB浓度均明显低于空质粒组和创伤组(P<0.05或P<0.01)。结论AQP4 siRNA治疗能够下调AQP4的表达水平，有效减轻大鼠TBE的程度，推测AQP4表达下调可以减少血脑屏障的通透性，抑制脑水肿的发展。

创伤性脑水肿；水通道蛋白4；血脑屏障

创伤性脑水肿(TBE)多数是由颅脑损伤所致，以颅内压升高为主要特征〔1〕。TBE的发生机制目前尚不完全清楚，而且，临床上也缺少有效的治疗药物和方法。因此，寻找TBE的有效治疗方法成为目前研究的热点〔2〕。目前，TBE的机制存在诸多学说〔3～5〕，其中血脑屏障损伤学说被认为是早期脑水肿发生的重要原因。水通道蛋白(AQP)4是一种跨膜通道蛋白，主要分布于中枢神经系统中〔6,7〕，转运水分子时的耗能低，而且对水分子的选择性较高〔8〕。动物实验显示，AQP4基因敲除小鼠在脑损伤后脑水肿的程度显著下降。体外研究中，siRNA转染星形胶质细胞可以下调其AQP4的表达〔9〕。本研究通过AQP4 siRNA转染TBE大鼠模型，观察其对脑组织AQP4表达水平和脑水肿程度的影响。

1 材料和方法

1.1实验动物、仪器、试剂 10周龄雄性Wistar大鼠336只，平均体重280 g，动物饲养及操作符合本省实验动物管理委员会的要求，饲养间的温度保持在25℃，相对湿度控制在40%～70%，尽量使大鼠不要受到噪音的影响，每天定时为大鼠笼舍进行卫生清洁，标准饲料及其他与动物接触的物品均经高压灭菌处理，确保大鼠能够健康饲养。手术显微镜；显微手术器械；大鼠脑离体定向仪；电子分析天平；AQP4 siRNA质粒；大鼠体内转染试剂；浓缩型SABC-Cy3试剂盒。

1.2大鼠TBE模型的建立 使用戊巴比妥钠麻醉大鼠，并俯卧固定于手术面板上。确定大鼠脑颅的正中线，剪开约1.5 cm的切口，分离皮下组织及骨膜。将大鼠转移置海绵上，采用冠矢状缝交点为中心将垫片放置于大鼠颅骨正中线，从1.7 m高度使用打击棒以自由落体的速度击打垫片。待大鼠生命体征稳定后，转移至手术面板上，充分暴露颅骨后，在显微镜下确定冠矢状缝交点右侧1 mm处为中心点，使用魔钻造开骨窗，控制半径为0.25 cm。

1.3动物分组 健康雄性Wistar大鼠336只，随机分为创伤组、治疗组、空质粒组和假手术组，每组84只。创伤组大鼠造模后即缝合头皮。治疗组大鼠造模后，于冠状缝前1.0 mm、中线偏右侧1.5 mm处，使用微量注射器垂直进针约3 mm，注射AQP4 siRNA质粒(质粒与大鼠体内转染试剂按照1∶1比例混合)，注射质粒后即缝合头皮。空质粒组大鼠造模后，采取以上相同方式注射不含AQP4 siRNA的空质粒。假手术组大鼠造模时，不进行击打，并且采取以上相同方式注射生理盐水。

1.4脑组织含水率的测定 4组按照4、12、24、48、96、120、168 h共7个时间点，每组各随机抽取4只大鼠，断头处死后取脑组织，使用滤纸吸干脑组织表面液体后使用电子分析天平称量脑组织湿重，然后将脑组织放在100℃的烘箱中1 d，称量其干重，脑组织含水率=(湿重-干重)/湿重×100%。

1.5伊凡思蓝(EB)浓度测定 用生理盐水配制浓度分别为8.0、4.0、2.0、1.0、0.5、0.25 μg/ml的EB标准液，使用分光光度计测定OD632值，制作EB标准曲线。

每组在不同时点(同1.4)各随机抽取4只大鼠，在各检测时间点前2 h按照3 ml/kg的剂量注射EB溶液。2 h后将大鼠断颈取脑并确定脑损伤中心位置。称取约100 mg脑组织，放置于含有二甲基甲酰胺的试管中，60℃水浴24 h后，1 500 r/min离心10 min，抽取上清液。使用分光光度计测定OD632值，同时取双蒸水作为空白对照。参照EB标准曲线，计算脑组织中的EB浓度。

1.6AQP4 mRNA原位杂交 各组在各时间点(同1.4)均随机抽取4只大鼠，取大鼠脑组织制作石蜡切片，常规脱蜡后，双氧水处理以暴露mRNA的核酸片段。以人工合成的地高辛标记的大鼠AQP4靶基因的mRNA作为寡核苷酸探针，进行AQP4 mRNA原位杂交。然后，以HRP标记的鼠抗地高辛作为二抗与杂交复合物反应，最后进行二氨基联苯胺(DAB)显色。封片后在显微镜下进行观察，每张切片随机选择5个不重叠的视野采集图像，图像分析软件计算脑组织中单位面积内AQP4 mRNA的平均表达量。

1.7统计学处理 采用SPSS17.0软件，组间比较采用单因素方差分析和多重比较。

2 结 果

2.1各组大鼠脑组织含水率和EB浓度 创伤组大鼠脑组织的含水率于脑损伤后4 h开始增加，72 h达到高峰，随后开始下降，而假手术组大鼠脑部含水率随时间无明显变化。AQP siRNA治疗后，脑损伤大鼠各时间点的脑组织含水率均明显低于创伤组和空质粒组，但仍高于假手术组(P<0.05或P<0.01)。说明AQP4 siRNA治疗可以减轻大鼠脑损伤后脑水肿的程度。创伤组脑组织中的EB浓度随时间增加而增加，损伤后72 h达到高峰。随后开始逐渐降低，而假手术组大鼠脑组织中EB浓度随时间无明显变化。说明脑水肿动物模型制备成功。治疗组各时间点EB浓度均明显低于创伤组和空质粒组(P<0.05或P<0.01)，但仍高于假手术组(P<0.05或P<0.01)，说明AQP4 siRNA可能通过改变血脑屏障的通透性调节脑组织的含水量，从而抑制脑水肿的发生和发展。见表1和表2。

表1 各组大鼠脑组织含水率

与创伤组、空质粒组和假手术组比较：1)P<0.05，2)P<0.01;下表同

表2 各组大鼠脑组织EB浓度

2.2AQP4 siRNA对大鼠脑组织AQP4 mRNA表达的影响 创伤组大鼠脑组织中的AQP4 mRNA表达水平于损伤后4 h开始增加，48 h达到高峰，随后逐渐下降。而假手术组大鼠脑内AQP4表达水平无明显变化。AQP4 siRNA治疗后，脑损伤大鼠各时间点脑内AQP4 mRNA表达水平均明显低于创伤组和空质粒组，但仍明显高于假手术组相应时间点(均P<0.05)。见图1。

与创伤组、空质粒组和假手术组比较：1)P<0.05；与创伤组和空质粒组比较：2)P<0.05图1 各组大鼠脑组织AQP4 mRNA的表达水平

3 讨 论

TBE主要分为两大类，即细胞毒性脑水肿以及血管源性脑水肿〔10，11〕。无论是细胞毒性脑水肿还是血管源性脑水肿，最终都表现为水分子平衡的打破。

既往研究表明，AQPs在维持脑内水平衡方面发挥着至关重要的作用，为研究体内水平衡以及水分子的转运开创了新的领域〔12，13〕。近年来，AQP4参与脑内水转运、维持水平衡的研究日益增多。研究发现，AQP4基因敲除小鼠脑损伤后，出现脑水肿的概率及脑水肿的程度均明显低于野生型小鼠〔14〕。而上调大鼠体内AQP4的表达，可促进大鼠脑损伤后脑水肿的发生发展。本研究结果显示，大鼠脑损伤后，如不加以任何干预治疗(空质粒组和创伤组)，其脑水肿程度随时间增加呈上升趋势，72 h到达峰值，而AQP4 siRNA治疗组大鼠脑受损后脑水肿的程度较空质粒组和创伤组明显降低。进一步分析发现治疗组大鼠脑组织内AQP4 mRNA的变化趋势与脑水肿变化趋势基本一致，而假手术组大鼠脑组织AQP4 mRNA的表达水平随时间无明显变化。证明AQP4参与了脑水肿的发生发展，而且AQP4表达下调可以有效减轻大鼠TBE的程度，这与既往的研究报道〔14〕一致。

研究表明，当血脑屏障通透性增加时，EB可以进入血管内，与血管内的蛋白成分结合，并转移到组织间隙〔15〕。因此，检测损伤脑组织中的EB浓度可以间接反映血脑屏障的通透性改变。研究结果显示，EB浓度的变化趋势与AQP4 mRNA表达以及脑水肿程度的变化趋势基本一致，提示AQP4 siRNA治疗降低了血脑屏障的通透性。因此，我们推测AQP4可能通过调节血脑屏障的通透性参与了脑水肿的发生发展过程。在外力所致脑损伤等应激情况下，AQP4表达增加，从而增加血脑屏障的通透性，脑组织内含水率增加，发展成脑水肿。而siRNA干扰能抑制或减少AQP4的表达，进而减少血脑屏障的通透性，减轻脑水肿的程度。

1Ali A，Konakondla S，Zwagerman NT，etal.Glycerol accumulation in edema formation following diffuse traumatic brain injury〔J〕.Neurol Res，2012；34(5)：462-8.

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3Higashida T，Kreipke CW，Rafols JA，etal.The role of hypoxia-inducible factor-1α，aquaporin-4，and matrix metalloproteinase-9 in blood-brain barrier disruption and brain edema after traumatic brain injury：laboratory investigation〔J〕.J Neurosurg，2011；114(1)：92-101.

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6Clausen F，Hånell A，Israelsson C，etal.Neutralization of interleukin-1β reduces cerebral edema and tissue loss and improves late cognitive outcome following traumatic brain injury in mice〔J〕.Eur J Neurosci，2011;34(1)：110-23.

7Fukuda AM，Pop V，Spagnoli D，etal.Delayed increase of astrocytic aquaporin 4 after juvenile traumatic brain injury：possible role in edema resolution〔J〕?Neuroscience，2012;222：366-78.

8Beziaud T，Chen XR，El Shafey N，etal.Simvastatin in traumatic brain injury：effect on brain edema mechanisms〔J〕.Crit Care Med，2011;39(10)：2300-7.

9Chen SJ，Yang JF，Kong FP，etal.Overactivation of corticotropin-releasing factor receptor type 1 and aquaporin-4 by hypoxia induces cerebral edema〔J〕.Proc Nat Acad Sci，2014;111(36)：13199-204.

10Kenne E，Erlandsson A，Lindbom L，etal.Neutrophil depletion reduces edema formation and tissue loss following traumatic brain injury in mice〔J〕.J Neuroinflammation，2012;9(1)：17.

11Laird MD，Sukumari-Ramesh S，Swift AEB，etal.Curcumin attenuates cerebral edema following traumatic brain injury in mice：a possible role for aquaporin-4〔J〕.J Neurochem，2010;113(3)：637-48.

12Lescot T，Fulla-Oller L，Palmier B，etal.Effect of acute poly (ADP-ribose) polymerase inhibition by 3-AB on blood-brain barrier permeability and edema formation after focal traumatic brain injury in rats〔J〕.J Neurotrauma，2010;27(6)：1069-79.

13Yang K，Cao F，Sheikh AM，etal.Up-regulation of Ras/Raf/ERK1/2 signaling impairs cultured neuronal cell migration，neurogenesis，synapse formation，and dendritic spine development 〔J〕.Brain Struc Func，2013;218(3)：669-82.

14Shahrokhi N，Khaksari M，Soltani Z，etal.Effect of sex steroid hormones on brain edema，intracranial pressure，and neurologic outcomes after traumatic brain injury〔J〕.Canad J Phys Pharmacol，2010;88(4)：414-21.

15Jain KK.Role of nitric oxide in neurological disorders 〔J〕.Humana Press，2013;31(6)：249-82.

〔2016-11-15修回〕

(编辑 徐 杰)

R651.1

A

1005-9202(2017)18-4493-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.027

1 海南省中医院脑病科

吴川丽(1981-)，女，主管护师，主要从事中医急诊研究。