六味地黄丸对自发性2型糖尿病模型小鼠肝、肾和胰腺组织学变化的影响

吕 璐 郑源强 张精彩 李斯琦 王晓东 尹 星 徐 佳 韩新荣 石艳春

(内蒙古医科大学自治区分子生物学重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010058)

六味地黄丸对自发性2型糖尿病模型小鼠肝、肾和胰腺组织学变化的影响

吕 璐 郑源强 张精彩1李斯琦1王晓东1尹 星1徐 佳1韩新荣1石艳春

(内蒙古医科大学自治区分子生物学重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010058)

目的探讨不同剂量六味地黄丸对自发性2型糖尿病(T2DM)模型小鼠肝脏、肾脏和胰腺组织学变化的影响。方法将6～8周龄自发性T2DM模型小鼠(KK-Ay小鼠)随机分为无药对照组、低剂量组和高剂量组，C57BL/6J小鼠作为遗传对照组。各组小鼠分别给予蒸馏水或六味地黄丸灌胃15 w。给药15 w后，HE染色观察小鼠肝脏、肾脏和胰腺组织学变化。结果给药组小鼠肝脏、肾脏和胰腺组织病变明显减轻。低剂量组对小鼠肝脏的保护效果优于高剂量组；高剂量组对肾脏病变的治疗效果好于低剂量组；低剂量组对胰岛内胰岛细胞具有明显的保护作用。结论六味地黄丸对自发性T2DM所致的实验小鼠肝脏、肾脏和胰腺组织病理性改变具有明显的改善作用，且与给药剂量相关。

2型糖尿病；六味地黄丸；肝脏；肾脏；胰腺

2型糖尿病(T2DM)的发病机制、治疗措施等研究一直是生命科学研究领域的热点课题〔1,2〕。T2DM常见并发症包括肾病、神经病变、眼病及感染等。六味地黄丸常用于糖尿病及其并发症的治疗，可单独使用或者与西药联合用药，疗效明显〔3,4〕。前期实验结果表明，六味地黄丸对自发性T2DM模型小鼠(KK-Ay小鼠)高血糖和肥胖具有一定的治疗作用，并且能够降低血清和胰岛内胰岛素表达水平〔5〕。本研究探讨不同剂量六味地黄丸对自发性T2DM模型小鼠肝脏、脾脏和胰腺组织学变化的影响。

1 材料与方法

1.1主要试剂及仪器 浓缩六味地黄丸〔北京同仁堂(集团)有限责任公司〕；组织包埋机(BKJ)、石蜡切片机(LEICA)等。

1.2实验动物及分组 自发性T2DM模型小鼠(SPF级KK-Ay小鼠，雌性)24只，6～8周龄，随机分为3组，每组8只，即无药对照组、低剂量组和高剂量组。C57BL/6J小鼠8只，雌性，6～8周龄。KK-Ay小鼠和C57BL/6J小鼠的体质量均为18～20 g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK(京)2014-0004。C57BL/6J小鼠作为遗传对照组。高糖饲料：购自北京华阜康生物科技股份有限公司，许可证号：SCXK(京)2009-0008。

1.3小鼠灌胃给药与饲养 各组小鼠购买后先进行2 w适应性饲养，并且全程给予高糖饲料。第3周开始灌胃给药，各组每只小鼠灌胃0.1 ml/次，2次/d。六味地黄丸用灭菌蒸馏水配成混悬液，低剂量组和高剂量组给药浓度分别为70 mg/ml和140 mg/ml(按照浓缩六味地黄丸药品说明书并根据开始灌胃时全部小鼠平均体重为37.51 g，综合换算给药量。140 mg/ml是按正常成人给药剂量换算而得，70 mg/ml为减半给药剂量)；无药对照组和遗传对照组给予等剂量无菌蒸馏水。

1.4小鼠组织脏器的收集、制片及染色 灌胃给药15 w后，各组小鼠脱颈处死后，常规条件下取肝脏、肾脏和胰腺，4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋，常规HE染色，显微镜下观察。

2 结 果

2.1各组小鼠肝脏HE染色检测结果 与遗传对照组相比，无药对照组小鼠肝脏脂肪空泡较多且几乎所有肝细胞脂肪变性明显；低剂量组虽然也存在脂肪空泡且极少有肝细胞脂肪变性；高剂量组偶有脂肪空泡，肝细胞脂肪变性也较明显，部分肝细胞脂肪变性得到改善(图1)。表明六味地黄丸对T2DM模型小鼠肝脏具有保护作用，且低剂量组对肝细胞脂肪变性的治疗效果优于高剂量组。

2.2各组小鼠肾脏HE染色检测结果 (图2)遗传对照组肾脏组织形态正常，肾小球规则，肾小管排列整齐，肾小管上皮细胞形态正常；无药对照组小鼠肾小球肥大、毛细血管基底膜增厚，系膜基质增生，肾小管上皮细胞空泡样变；给药组小鼠肾脏病变明显轻于无药对照组，且高剂量组更轻，仅有少量肾小管上皮细胞空泡样变，表明六味地黄丸对T2DM小鼠伴发的肾脏损伤具有改善作用，且高剂量组效果优于其他组。

图1 各组肝脏HE染色结果(×100)

图2 各组肾脏HE染色结果(×100)

2.3各组小鼠胰腺HE染色检测结果 遗传对照组胰岛为形状规则的椭圆形或圆形的细胞团，界线清楚，胰岛内细胞排列紧密。其余组均有胰岛代偿性增大，且无药对照组小鼠胰岛外形不规则，胰岛内组织结构松散，有空虚区域，部分胰岛细胞胞质空泡化。给药组胰岛病变均轻于无药对照组，其中低剂量组仍存在胰岛代偿性增大，但胰岛内细胞排列紧密；高剂量组胰岛代偿性增大现象得到明显改善，但胰岛内细胞数量较少，存在空虚区域(图3)。

图3 各组胰腺HE染色比较(×100)

3 讨 论

国际糖尿病联盟统计数据显示：2011年全球糖尿病人数已达到3.7亿，其中绝大部分存在于发展中国家，预计2035年全球将有近5.31亿糖尿病患者〔6〕。我国的流行病学调查显示：18岁以上人群糖尿病的患病率为9.7%，且以T2DM为主〔7〕。T2DM常伴有肾病、神经病变等并发症，但其发病机制尚不完全清楚。目前认为慢性低密度炎症反应是导致糖尿病的主要致病因素。炎症激活天然免疫系统导致机体长期处于低密度炎症状态、脂源性细胞因子及激素分泌紊乱，最终会导致糖尿病及其并发症的发生〔8,9〕。肝脏作为胰岛素作用的靶器官，在T2DM患者体内易发生胰岛素抵抗，加重机体代谢紊乱，而该病的脂代谢紊乱是形成非酒精性脂肪肝的独立危险因素〔10,11〕。糖尿病肾病是糖尿病常见的微血管病变的严重并发症之一，也是导致终末期肾病及死亡的主要原因〔12〕。

六味地黄丸是中医治疗肾阴虚的基础方。六味地黄丸(包括加减方)在临床实践中常用于辅助治疗糖尿病尤其是T2DM及其并发症，具有较好的治疗效果〔13,14〕。KK-Ay小鼠作为典型的自发性T2DM模型小鼠，与人的发病特征相似〔15〕。我们的前期结果显示，六味地黄丸能够降低KK-Ay小鼠血清和胰岛内胰岛素表达水平。在大鼠模型研究中，六味地黄丸也显示出对大鼠胰腺和胰岛β细胞具有保护作用〔16,17〕。糖尿病是一类代谢性疾病，肝脏、肾脏和胰腺的功能状态与糖尿病及其并发症的发生、发展与预后密切相关。本研究结果表明，六味地黄丸对糖尿病尤其是T2DM所致的模型动物肝脏、肾脏和胰腺损伤具有保护和治疗作用，但确切机制尚待进一步探讨。

1Doria A,Patti ME,Kahn CR.The emerging genetic architecture of type 2 diabetes〔J〕.Cell Metab,2008;8(3):186-200.

2Philippe AH,Kenneth SP,Donald WB,etal.β-cell failure in type 2 diabetes:postulated mechanisms and prospects for prevention and treatment〔J〕.Diabetes Care,2014;37(6):1751-8.

3谢 奇.六味地黄丸在2型糖尿病治疗中的作用与研究〔J〕.中医临床研究,2013;5(1):116-8.

4李征锋,陈 乔,何 红.六味地黄丸辅治2型糖尿病的疗效观察及对神经内分泌网络的影响〔J〕.江西医药,2014;49(9):860-1,866.

5吕 璐,郑源强,张精彩,等.六味地黄丸对自发性2型糖尿病模型小鼠胰岛素表达水平的影响〔J〕.中国免疫学杂志,2016;32(3):350-3.

6Ramachandran A,Snehalatha C,Ma RC.Diabetes in South-East Asia:an update for 2013 for the IDF Diabetes Atlas〔J〕.Diab Res Clin Pract,2014;103(2):231-7.

7中华医学会糖尿病学分会.中国2型糖尿病防治指南(2013年版)〔J〕.中国糖尿病杂志,2014;22(8):2-42.

8Johnson AM,Olefsky JM.The origins and drivers of insulin resistance〔J〕.Cell,2013;152(4):673-84.

9Winer S,Winer DA.The adaptive immune system as a fundamental regulator of adipose tissue inflammation and insulin resistance〔J〕.Immunol Cell Biol;2012;90(8):755-62.

10Nolan CJ,Damn P,Prentki M.Type 2 diabetes across generation：from pathophysiology to prevention and management〔J〕.Lancet,2011;387(9786):169-81.

11Rafiq N,Younossi ZM.Effects of weight loss on nonalcoholic fatty liver disease〔J〕.Semin Liver Dis,2008;28(4):427-33.

12隋燕霞,解立怡,赵东利.2型糖尿病合并肾损害177例临床病理分析〔J〕.诊断病理学杂志,2015;22(7):385-9,393.

13丘志峰.使用六味地黄丸治疗2型糖尿病肾病的疗效分析〔J〕.当代医药论丛,2015;13(7):45-6.

14钟飞鹏,刘笑云.六味地黄丸联合甲钴胺治疗糖尿病周围神经病变临床观察〔J〕.光明中医,2013;28(3):560-1.

15Tomino Y.Lessons from the KK-Ay mouse,a spontaneous animal model for the treatment of human type 2 diabetic nephropathy〔J〕.Nephrol Urol Mon,2012;4(3):524-9.

16李 佳,薛耀明,钱 毅,等.六味地黄丸对自发性糖尿病大鼠胰腺的保护作用〔J〕.南方医科大学学报,2010;30(6):1407-9.

17任雅瑾,马红英,陈晓文,等.六味地黄丸对糖尿病大鼠胰岛β细胞的保护作用〔J〕.中国中西医结合消化杂志,2013;21(9):475-8.

〔2017-06-14修回〕

(编辑 曹梦园)

R967

A

1005-9202(2017)18-4455-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.18.010

内蒙古自治区自然科学基金(2012MS1126)；内蒙古医科大学英才培育项目资助(2015年)

1 内蒙古医科大学护理学院

石艳春(1958-)，女，博士，教授，博士生导师，主要从事抗感染免疫与疫苗研究。 韩新荣(1957-)，男，硕士，教授，硕士生导师，主要从事中医药与免疫学研究。

吕 璐(1988-)，女，硕士，主要从事抗感染免疫与中药免疫研究。