一株草莓灰霉菌的生物学特征研究与鉴定

赵慧军 李志忠

（1.兰州职业技术学院，甘肃、兰州，730000；2.兰州理工大学，甘肃、兰州，730000）

一株草莓灰霉菌的生物学特征研究与鉴定

赵慧军1,2李志忠2

（1.兰州职业技术学院，甘肃、兰州，730000；2.兰州理工大学，甘肃、兰州，730000）

草莓灰霉病是影响草莓生产种植的主要病害，极易侵染导致草莓果实腐烂变质，严重危害草莓的产量品质和运输储存。本研究从染病草莓中分离纯化出一株灰霉菌株，结合形态学观察、生物学特征研究和ITS分子鉴定为灰葡萄孢菌（Botrytis sp.），为后续进行灰葡萄孢菌拮抗菌的筛选和草莓灰霉病的生物防治奠定了基础。

草莓；灰霉菌；生物学特征；鉴定

引言

草莓灰霉病是由半知菌亚门、葡萄孢属的灰葡萄孢菌侵染引起的植物病害［2］，由于其宿主广泛、致病性强，可以导致果蔬茎秆、叶片、果实的枯萎、腐烂和，严重影响果蔬的产量和品质［2］。

甘肃省兰州市红古区作为绿色农产品产业化示范区，土壤气候条件适合多品种草莓种植。本实验通对红古区花庄镇草莓标准化生产基地的调查采样，从感染灰霉病的草莓果实病斑中分离纯化一株灰霉菌，通过生物学特征检测和ITS分析鉴定，为后续进行灰葡萄孢菌拮抗菌的筛选和草莓灰霉病的生物防治提供了研究基础，对该地区种植和推广优质绿色无公害草莓具有现实意义。

1、材料与方法

1.1 试验园概况

本试验样品来自兰州市花庄镇河咀村草莓种植区(103°07′23.93″E，36°12′16.36″N)，海拔1580～1680m之间，属温带大陆性干旱气候。年平均气温7.6℃，年平均降水量327.7-349.9mm，年平均日照为1762-2769h，无霜期166d。主栽品种为杜克拉，属早熟品种，株行距为0.5×1m，参照国家标准《无公害食品草莓生产技术》（NY/5105—2002）川地草莓抗旱栽培技术进行管理。

1.2 材料与试剂

1.2.1 材料

在兰州市花庄镇河咀村草莓种植基地灰霉病高发区采摘感染灰霉的草莓样本（病果）7株。

1.2.3 试剂

PDA培养基；PDB发酵培养基；DNA提取试剂盒（购自北京索莱宝科技有限公司）；DNA电泳上样缓冲液(日本TaKaRa公司)；Taq酶(日本TaKaRa 公司)；D2000 DNA Marker(日本TaKaRa公司)；琼脂糖(西班牙Biowest公司)；DNA胶纯化试剂盒 (购自AXYGEN公司)；引物(invitrogen)。

1.3 试验方法

1.3.1 致病菌的分离纯化和形态观察

将感染严重的病果研磨后加入90mL无菌水充分振荡，稀释后配成不同浓度梯度的组织混合液，涂布到PDA平板24℃恒温培养。2d后挑取少量菌丝接种培养，稀释分离单孢纯培养［3］。分别观察培养2～5d菌丝、分生孢子、孢子梗及菌核的形态特征。

1.3.2 致病菌致病性研究

将健康草莓果实用无菌水洗净，在10%HgCl2溶液中浸泡8min，无菌水反复冲洗3次后滤纸吸取表面水分［5］，用接种针在草莓表面形成孔径为3～5mm创伤，用5mm打孔器在培养5d的灰霉平板上取菌碟［4］，接种到供试草莓创伤位置［3］。接种后的草莓果实放入组培罐中用滤纸保湿［5］，置于22℃培养箱内，观察4～5d后的感染情况。

1.3.3 分生孢子萌发形态观察

将培养5d的灰霉平板用0.3%吐温80洗脱收集孢子，配置浓度为1.0×106个/mL的孢子悬液［5］，各取200μl孢子菌悬液和800μLPDB发酵液加入EP管中充分震荡，对照组取200μl孢子菌悬液和800μL无菌水［6］；分别于20℃、22℃、24℃培养箱培养2d后观察孢子萌发形态。

1.3.4 致病菌分子鉴定

待测菌株的DNA提取使用真菌基因组DNA提取试剂盒，以该菌株DNA为模板，PCR扩增ITS片段，采用25µl扩增体系（见表1）。用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，纯化后切胶回收［2,6］，委托南京钟鼎生物技术有限公司完成测序。

表1 核糖体DNA反应体系的组成

2、结果与分析

2.1 灰霉菌形态学观察

在PDA平板培养基中分离纯化出一株灰霉菌株X，呈辐射状扩散，生长初期呈白色［7］(图1)，逐渐转为浅灰色，随着菌丝的蔓延生长颜色加深，变为深灰色或褐色(图2)，偶有脏绿色；分生孢子梗单支或树枝状分支，顶端膨大，上有小突起，分生孢子着生于突起上［5，7］(图3-4)，孢子呈卵圆形、椭球形(图5)。菌丝细长，多横隔，单个或多个分支［7］(图6)。

图1：接种2d的单菌落

图2：接种5d的菌落

图3：着生孢子囊的菌丝（4d）

图4：孢子梗(4d)

图5：分生孢子

图6：菌丝（5d）

2.2 灰霉菌分生孢子萌发

孢子萌发时，首先卵圆形一端形成突起，产生萌发管(图7)；在20℃下培养时孢子萌发率随着培养温度的增加而提高，22℃为孢子最适萌发温度，主要形成单个或2个萌发管；至24℃时，易形成3个或3个以上萌发管，且萌发管形成分支，菌丝生长迅速，总体萌发率降低［5］。

图7：孢子萌发初期

图8：20℃培养

图9：多萌发管

图10：22℃培养

图11：24℃培养

图12：对照组

2.3.灰霉菌果实复染

菌株X感染草莓果实表面着生灰色菌丝，引起果实肉质腐烂，随着菌丝的生长果实覆盖灰色霉层，表面呈粉状，随着病斑的扩大，颜色变深，霉层呈现深灰色伴随脏绿色［9］（如图13-14）。

图13：感染灰霉菌3d

图14：感染灰霉菌5d

2.4 灰霉菌分子鉴定

以菌株X的DNA为模板，对ITS基因进行PCR扩增，得到目标条带2号（如图15），经测序，菌株X的ITS序列长度为539bp。将ITS序列与Genbank中的相关序列进行BLAST比较，并采用DNAStar构建系统进化树［3,6］（如图16）。结果表明，与菌株X相似性最高的是Botrytis sp. isolate NO_9（KX427539.1），二者序列相似度达100%。

图15：PCR扩增产物

图16：ITS基因序列系统发育树

3、结论和讨论

综上所述，根据霉菌分类标准，通过对分离纯化的菌株进行形态学鉴定、生物学特征及分子生物学鉴定，根据同源性比较，该菌株X鉴定为灰葡萄孢菌（Botrytis sp. isolate NO_9）。

研究发现，分离自草莓、葡萄、辣椒、番茄、梨、洋葱果实等其他果蔬的灰葡萄孢菌都能感染草莓果实也叶片，因此要防止不同作物之间的致病菌感染［10,11］。本研究将继续对灰葡萄孢菌的生理生化特征及其对草莓的侵染影响因素、灰葡萄孢菌拮抗菌的筛选和生物防治等方面进一步深入研究［12-14］。

［1］张佳.中国草莓主产区灰霉病菌的多样性研究[D].北京:中国农业大学,2015.

［2］杨红玲.湖北省保护地草莓和番茄灰霉病流行规律研究[D].武汉:华中农业大学,2015.

［3］王艳玲,张紊玮,杨麦娟等.两种马铃薯干腐病镰刀菌的分离鉴定[J].中国食品工业,2016(1):51-53.

［4］皇甫运红.果蔬灰霉病菌对两种呼吸抑制剂的抗药性研究[D].浙江农林大学,2014.

［5］于昕.草莓灰霉菌（Botrytis cinerea）的分离鉴定及其拮抗菌对枇杷保鲜的研究[D].成都:四川大学,2016.

［6］王俊丽,卢彩鸽,刘伟成等.一株芽孢杆菌QD-10的鉴定及生防特征分析[J].中国生物防治学报,2014, 30(4): 564-572.

［7］李娜.湖北省保护地番茄/草莓灰霉病菌多样性研究[D].武汉:华中农业大学,2015.

［8］魏景超 真菌鉴定手册[M].上海:上海科学技术出版社,1979.9.

［9］王丹.不同作物灰霉病菌生物学特性的比较研究和番茄灰霉病的生防研究[D].雅安:四川农业大学,2008.

［10］李喜玲,高智谋,邱艳等.不同寄主来源的灰葡萄孢对草莓的致病力分化研究[C].中国菌物学第四届会员代表大会暨全国第七届菌物学学术讨论会：165-169

［11］李喜玲,高智谋,邱艳等.四种寄主来源的灰葡萄孢对草莓的致病力分化研究初报[J].园艺学报,2009,36（9）：1365-1369.

［12］王凌宇,廖晓兰,张亚.草莓灰霉病的防治研究进展[J].湖南农业科学，2015,(6):142-144.

［13］童蕴慧,纪兆林,徐敬友等.灰霉病生物防治研究进展[J].中国生物防治, 2003,19(3):131-135.

［14］闫小军,何锦豪,任明刚.大棚草莓灰霉病及其防治[J].蔬菜,2002,(1):24-25.

Identification and Biological Characteristics Analysis of Gray Mold in Strawberry

ZHAO Hui-jun1,2,LI Zhi-zhong2
（1.Lanzhou Vocational Technical College,Lanzhou,730000, China; 2.Lanzhou University of Technology,Lanzhou,730000,China)

Strawberry Botrytis Cinerea is the main disease that affects the production and cultivation of the strawberry and which makes the strawberry rotting and deteriorating easily.so the quality and transportation of it will also be affected. In this study, a strain of Botrytis Cinerea was detached and purified from the diseased strawberry. By studying the Morphological, Biological Properties and ITS Molecular, the strain was identified as Botrytis Sp, and all these have laid the foundation for the subsequent screening of Botrytis Sp and Biotic-control of Gray Mould of strawberry .

Strawberry；Gray Mold；Biological Characteristics；Identification

S432.4

A 文字编号;