葛根配方颗粒对小鼠前列腺增生的影响

黄 霆 王安喜 朱晓雨 程义东 徐玉峰

(南京中医药大学第三附属医院泌尿外科，南京，210001)

葛根配方颗粒对小鼠前列腺增生的影响

黄 霆 王安喜 朱晓雨 程义东 徐玉峰

(南京中医药大学第三附属医院泌尿外科，南京，210001)

目的：探讨葛根配方颗粒抑制小鼠前列腺增生的作用机制。方法：将60只4周龄的雄性昆明种小鼠随机分为6组：葛根颗粒10,20,30 mg/kg组、对照组(保列治组)1 mg/kg、造模组及正常组。将除正常组外的小鼠手术去势7 d后，给予丙酸睾酮5 mg(/kg·d)皮下注射，同时分别给予不同剂量的葛根配方颗粒、保列治灌胃3周。后摘取各组小鼠前列腺，称重并计算前列腺指数(PI)，免疫组化检测前列腺组织FGF2，Ki67，TGF-β1蛋白的表达，免疫酶联吸附试验(ELISA)检测5-还原酶活性，TUNEL试剂盒检测细胞凋亡情况。结果：与造模组比较，各给药组小鼠前列腺质量、PI均显著减小(P<0.05)，FGF2，Ki67，TGF-β1抗原表达、5-还原酶活性均显著降低(P<0.05)，细胞凋亡指数显著增高(P<0.05)；而各项指标在葛根20，30 mg/kg组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论：葛根配方颗粒对小鼠前列腺增生有明显抑制作用，其可能的机制是抑制FGF2，Ki67，TGF-β1抗原表达，降低5-还原酶活性，增加细胞凋亡，从而机制鼠前列腺增生。

葛根配方颗粒；前列腺增生；昆明种小鼠；保列治

良性前列腺增生症(Benign Prostatic Hypertrophy，BPH)是常见的中老年男性进行性疾病[1]。随着社会的老年化，BPH的患病率明显增高[2]。但就良性前列腺增生的病因而言，国内外学者尚未明确。公认的两大因素是年龄的增大以及雄激素失衡。目前主要的治疗手段包括手术治疗和药物治疗。手术主要包括传统的开放手术和微创手术。微创手术中的经尿道前列腺电切术(TURP)、经尿道前列腺等离子双极电切术(TUPK)已经成为国内外泌尿外科医师治疗前列腺增生术式的金标准。药物治疗则主要有-肾上腺受体阻滞剂，5-还原酶抑制剂、抑制胆固醇类药、花粉制剂等。但这些药物长期使用存在一定的不良反应，寻找一种有效无毒、药食两用的中药防治BPH意义重大。本研究以去势小鼠加丙酸睾酮皮下注射诱发小鼠BPH模型，观察葛根颗粒对BPH小鼠前列腺湿重、指数、5-还原酶活性、FGF2，Ki67，TGF-β1蛋白及前列腺细胞TUNEL凋亡指数的影响。

1材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 4周龄昆明种雄性小鼠，体重(22±2)g，SPF级，购自上海杰思捷实验动物有限公司，实验动物许可证号SCXK(沪)2014-0006。

1.1.2 药物 葛根配方颗粒(江阴天江药业有限公司生产，批号1602103，1512046)，每袋装1 g相当于饮片10 g，充分溶解至20 mL沸水中，待冷却后制成溶剂；保列治(杭州默沙东制药有限公司生产，批号L003889)，在研钵内充分研磨后溶解至10 mL蒸馏水中制成溶剂；丙酸睾酮注射剂(上海通用药业股份有限公司，批号131218)；科研用分析纯水合氯醛(上海展云化工有限公司生产，批号20151102)，调配成10%的水合氯醛注射液。

1.1.3 试剂与仪器 Anti-TGF beta1抗体(批号601338204)、Anti-BFGF抗体(批号603933001)、Anti-Ki67抗体(批号603605803)，均购自美国ABCAM公司。二抗，兔kit(批号603447703)、NovoLinkTM polymer dilution(批号6005303)，均购自珠海泉晖公司。5α-还原酶活性ELISA试剂盒：购自Angle Gene ELISA检测试剂盒。TUNEL染色试剂盒(50T)：In situ cell death detection kit，POD 11684817910(罗氏Roche公司生产)。

低温高速离心机(Centrifuge 581 OR)：德国Eppendorf公司；可调式微量移液器：德国Eppendorf公司；高压消毒锅：上海申安医疗器械厂；超净工作台：上海博讯实业有限公司；酶标仪：赛默飞世尔科技(中国)有限公司;烧杯，电子天平，研钵，灌胃针，无酶EP管。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 依据参考文献[3-5]进行动物模型制备，将小鼠随机分为葛根10，20，30 mg/kg组、对照组(保列治组)、造模组及正常组。对照组及葛根组给药剂量按照文献折算成小鼠用量。除正常组外，其余各组肌内注射丙酸睾丸酮5.0 mg/(kg·d)。

1.2.2 给药方法 葛根颗粒低、中、高剂量组分别给予10 mg/kg，20 mg/kg，30 mg/kg灌胃，保列治对照组给予1 mg/kg灌胃，连续21 d，每周复测体重调整灌胃剂量。

1.2.3 检测指标与方法 最后1次给药24 h后将各组动物称重后处死，取前列腺称湿重。

前列腺指数测定：将取材后的前列腺标本予电子天平称重，计算前列腺湿重指数PI=前列腺湿重/小鼠体重。

根据ELISA试剂盒说明书检测5α-还原酶活性。1)样品制备：将组织加入适量生理盐水进行匀浆液，1 000×g离心10 min，取上清液备用。2)标准品的稀释：准备5只标号的小试管分别加入标准品稀释液100 μL，然后取原浓度标准品150 μL加入一支已编好号的试管中，充分混匀；再在该试管中取200 μL加入第2支试管中，充分混匀；后依次取出100 μL加入到下一支试管中并充分混匀。在酶标包被板上设标准品孔，依次加入稀释后的标准品50 μL。3)加样：在酶标包被板上待测样品孔中先加样品40 μL，然后再加生物素标记的抗体10 μL。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。4)温育：用封板膜封板后置37 ℃恒温箱中温育30 min。5)配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。6)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30 s后弃去，如此重复5次后拍干。7)加酶：每孔加入酶标试剂50 μL。8)温育：操作同4。9)洗涤：操作同6。10)显色：每孔先加入显色剂A 50 μL，再加入显色剂B 50 μL，轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色15 min。11)终止：每孔加终止液50 μL，终止反应(此时蓝色立转黄色)。12)测定：用酶标仪在450 nm波长状态下测量各孔的吸光度(A值)。

通过TUNEL染色试剂盒说明书观察细胞凋亡情况。1)切片常规脱蜡入水。2)将一烧杯盛200 mL的0.01 mol/L、pH6.0的柠檬酸缓冲液，加热至90～95 ℃，迅速放入切片，使用680 W(80%功率)、微波照射1 min，加入双蒸水(20～25 ℃)80 mL作迅速冷却，将玻片移至PBS(20～25 ℃)。3)PBS洗5 min×3次。4)加20%正常牛血清室温30 min。5)将TUNEL反应混合液加在切片上，37 ℃温育90 min。6)PBS洗5 min×3次。7)3%H2O2甲醇液室温阻断10 min。8)37 ℃温育90 min。9)加POD转化剂，37 ℃温育30 min。10)PBS洗5 min×3次。11)DAB/H2O2显色。12)苏木素淡染，常规脱水，透明，中性树胶封固。细胞核呈棕色颗粒者为阳性细胞，结合形态特征，可确立凋亡细胞。阴性对照片无棕色颗粒。将部分前列腺标本行常规苏木精-伊红(HE)染色，在光镜下观察小鼠前列腺腺体增生情况。每例标本均进行HE染色，光镜下观察细胞形态变化。HE染色步骤：10%甲醛溶液固定、石蜡包埋、4 μm连续切片，HE染色，光镜下观察前列腺结构，照相。

按照购自ABCAM公司的抗体的说明书，并分别做出TGF，Ki67，BFGF免疫组化切片。采用免疫组化超敏二步法法。取上述标本4 μm厚连续切片，经二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水后行免疫组化染色。切片脱蜡至水，PBS洗3次×5 min；柠檬酸抗原修复10 min，自然冷却；PBS浸泡5 min，3次；3% H2O2封闭内源性过氧化物酶，室温20 min；PBS浸泡5 min，3次；滴加山羊血清50 μL/片，室温内源性生物素封闭20 min；甩除勿洗，滴加一抗(Ki-67，bFGF，TGF-β1，1∶100)50 μL/片，4 ℃过夜；PBS浸泡5 min，3次；滴加二抗50 μL/片，37 ℃ 30 min；PBS浸泡5 min，3次；滴加辣根过氧化物酶标记卵霉链白素50 μL/片，37 ℃30 min；PBS浸泡5 min，3次；抗原修复采用高温高压修复法，蒸汽冒出持续2 min后自然冷却，其后按试剂盒说明书进行DAB显色、苏木精复染、中性树脂封片、显微镜下观察。TGF-β1阳性表达位于前列腺间质细胞的平滑肌细胞质、上皮细胞质内，呈淡黄色至棕褐色颗粒；FGF2阳性表达位于前列腺间质及上皮细胞质内，呈棕黄色颗粒；Ki-67阳性表达位于前列腺细胞核，呈棕色颗粒。

2结果

2.1 葛根配方颗粒对小鼠前列腺湿重、指数的影响 造模组与正常组小鼠比较，前列腺湿重及PI均显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)；葛根组20，30 mg/kg及对照组与造模组比较，小鼠前列腺湿重、PI显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；葛根组10 mg/kg与造模组比较、葛根组30 mg/kg与葛根组20 mg/kg比较、对照组与葛根组20 mg/kg比较各指标间差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 葛根配方颗粒对小鼠前列腺湿重、 指数的影响

注:与正常组比较，*P<0.05；与造模组比较，△P<0.05

2.2 葛根配方颗粒对小鼠前列腺组织FGF2，Ki67，TGF-β1蛋白表达的影响 对各组(除正常组)小鼠前列腺组织免疫组化检测发现，造模组FGF2，Ki67，TGF-β1蛋白阳性率明显高于其他各组，差异有统计学意义(P<0.05)；对照组、葛根组20，30 mg/kg的FGF2，Ki67，TGF-β1蛋白阳性率显著低于葛根组10 mg/kg，差异有统计学意义(P<0.05)；对照组、葛根组30 mg/kg的FGF2，Ki67，TGF-β1蛋白阳性率与葛根组20 mg/kg差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 葛根配方颗粒对小鼠前列腺组织FGF2，Ki67， TGF-β1蛋白表达的影响

注:与造模组比较，*P<0.05；与葛根组(10 mg/kg)比较，△P<0.05

2.3 葛根配方颗粒对小鼠前列腺组织5α-还原酶活性及细胞凋亡的影响 造模组小鼠前列腺组织5α-还原酶活性明显高于正常组，而细胞凋亡指数明显低于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)；对照组、葛根组20、30 mg/K小鼠前列腺组织5α-还原酶活性明显低于造模组，而细胞凋亡指数明显高于造模组，差异有统计学意义(P<0.05)；对照组、葛根组30 mg/K与葛根组20 mg/K比较，5α-还原酶活性及细胞凋亡指数差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。6组TUNEL染色结果见图1。

表3 葛根配方颗粒对小鼠前列腺组织5α-还原酶活性及细胞凋亡的影响

注:与正常组比较，*P<0.05；与造模组比较，△P<0.05；与对照组比较，▲P<0.05

图1 6组小鼠前列腺TUNEL染色结果

3讨论

前列腺增生在老年男性属常见病、多发病，据报道，我国BPH发病率为7.9% ～28%[6]。本病因可导致下尿路梗阻、尿潴留、尿路感染甚至损伤肾功能[7]而越来越受到关注。到目前为止，良性前列腺增生症的病因及发病机制尚未明确，国内外学者通过大量研究提出多种学说：上皮-间质细胞相互作用学说、细胞凋亡学说、内分泌激素作用学说、生长因子学说等[8]。葛根又名“亚洲人参”，其药用价值极高。葛根甘、平，多食可行小便，具有活血通络、升阳活血、活血助补的功效[9]。有研究表明，葛根异黄酮可明显降低大鼠前列腺湿重、体积及PI，可缓解大鼠前列腺增生的症状，形态学上表现为上皮变薄，腺腔内分泌物减少，间质减少等[10]。大豆苷元是一种植物雌激素，其结构与雌二醇相似。曾靖[11]等研究表明：3′-大豆苷元磺酸钠对丙酸睾丸酮所致小鼠前列腺增生具有拮抗作用；其机制可能与降低小鼠血清T，E2，T/E2及其抑制雌激素受体的表达有关。本研究通过研究葛根配方颗粒对BPH小鼠前列腺湿重、指数、5-还原酶活性，FGF2，Ki67，TGF-β1蛋白及前列腺细胞凋亡指数的影响，从而初步探讨葛根配方颗粒抑制小鼠前列腺增生的作用机理。

碱性成纤维细胞生长因子(Basic Fibroblast Growth Factor，bFGF)在正常前列腺组织中少量表达，但在BPH中表达却明显升高[12]。Ki-67能客观地反映细胞的增殖程度，因此，Ki-67高表达是细胞增殖过度的重要标志[13]。Royuela等[14]指出，在正常情况下,TGF-β1只在前列腺基底上皮细胞及结缔组织基质中表达，而在BPH组织中既表达于基底上皮细胞,也表达于分泌柱状上皮细胞。Luo[15]等研究也发现，TGF-β1在BPH组织中表达增高。医学界大多数学者认为DHT是导致BPH的直接原因[16-17]。而5α-还原酶的作用之一是将睾酮(T)转变为双氢睾酮(Dihydrotestosterone，DHT)，因此5α-还原酶亦可作为BPH的间接致病因素。

目前，保列治(非那雄胺)在治疗BPH方面有着显著的临床疗效[16-17]，本研究将保列治治疗小鼠BPH作为对照组，观察葛根颗粒治疗小鼠BPH的疗效情况。根据结果提示，保列治1 mg/kg、葛根20、30 mg/kg处理小鼠后，其前列腺湿重、指数、FGF2，Ki67，TGF-β1阳性率、5α-还原酶活性明显下降，细胞凋亡指数明显升高，可见葛根配方颗粒对小鼠BPH有抑制作用。而葛根20、30 mg/kg与保列治1 mg/kg在处理小鼠BPH后各参数无明显差异，说明一定量的葛根颗粒可达到与保列治相近的疗效。本研究不足之处是,1)小鼠模型数量较少；2)未能明确起效的具体葛根药量。这些需要在后续的研究中进一步改进。

本研究通过检测BPH小鼠前列腺FGF2，Ki67，TGF-β1阳性率、5α-还原酶活性，细胞凋亡指数，发现经葛根颗粒处理后，5α-还原酶活性，FGF2，Ki67，TGF-β1表达下降，细胞凋亡指数增高。有研究证明，DHT可增加FGF2生成，从而促进前列腺间质增生[18]，而DHT主要由5α-还原酶促进生成。因此我们推断，葛根颗粒可通过降低5α-还原酶活性，从而下调FGF2，Ki67，TGF-β1等蛋白表达，进而增加细胞凋亡。

综上所述，葛根配方颗粒可降低BPH小鼠前列腺5-还原酶活性，抑制FGF2，Ki67，TGF-β1等蛋白表达，增加细胞凋亡，从而阻遏小鼠前列腺增生。

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(2016-10-10收稿 责任编辑：杨觉雄)

GegenpeifangGranulesinBenignProstaticHyperplasiaofMice

Huang Ting,Wang Anxi,Zhu Xiaoyu,Cheng Yidong,Xu Yufeng

(TheThirdAffiliatedHospitalofNanjingUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanjing210001,China)

Objective:To explore the mechanism of Gegenpeifang Granules in benign prostatic hyperplasia of mice.Methods:Sixty male mice from Kunming,all four weeks of age,were randomly divided into 6 groups,including Gegenpeifang Granules 10,20,30 mg/Kg groups,a control group (finasteride) 1 mg/Kg,a model group and a normal group.Except a normal group,mice of other groups were given testosterone propionate 5 mg / kg / d by subcutaneous injection at 7 days after surgical castration.Different dose of Gegenpeifang Granules and finasteride were given by gavage for 3 three weeks.After that,mice were broken neck to death and their prostates were weighed and prostate index (PI) was calculated,detecting the expression of FGF2,Ki67,TGF-β1by immunohisochemical method and 5a-reductase activity by ELISA,the apoptosis index by TUNEL kit.Results:Comparing with the model group,other groups had a signify-cantly reduce of prostatic volume,prostatic index,FGF2,Ki67,TGF-β1,5 a-reductase(P<0.05),while had a higher apoptosis index(P<0.05).There had no statistical difference between kudzu root20、30 mg/Kg groups and finasteride group(P>0.05).Conclusion:The Gegenpeifang Granules may shrink prostatic volume of mice by reducing the activity of 5a-reductase,inhibiting the expression of FGF2，Ki67，TGF-β1,promoting cell apoptosis,and thus straining prostatic volume of mice.

Gegenpeifang granules；Prostatic hyperplasia；Kunming mice；Finasteride

R242；R229

：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.09.042

南京市医学科技发展重点项目课题(ZKX14047)

黄霆(1977.01—)，男，硕士学位，副主任医师，主要从事中西医结合泌尿外科研究，E-mail：tingyan128@sina.com

王安喜(1965.01—)，男，博士学位，主任医师，主要从事中西医结合泌尿外科研究，E-mail：Szdrwang@126.com