2型糖尿病小鼠心脏缺血—再灌注后GDF11的表达变化

冯建宇 冯建梅 谭延振 冯笑

【摘 要】目的：观察2型糖尿病小鼠心脏GDF11表达情况及心肌GDF11的表达与糖尿病心肌缺血/再灌注损伤的关系。方法：40只C57BL/6J小鼠随机分为正常假手术组（Con+Sham）、正常缺血再灌注组（Con+MIR）、糖尿病假手术组（DM+Sham）、糖尿病缺血再灌注组（DM+ MIR）。 用高脂饲料加小剂量链脲佐菌素建立 2型糖尿病小鼠模型。用结扎心脏冠状动脉左前降支 30 min 后再灌注建立心肌 I/R 损伤模型。用 Western blot 法检测心肌中 GDF11 的表达量。结果： 与正常对照组相比，糖尿病组心肌组织 GDF11 的表达量明显下调均（ P <0.01）；缺血再灌注后正常组和糖尿病组心肌组织 GDF11 的表达量均较缺血前显著降低（均 P <0.01） ，尤其在糖尿病组下降更显著（均 P <0.01）。结论：2型糖尿病小鼠心肌 GDF11 表达水平降低和缺血再灌注后心肌组织 GDF11 的表达量下降，提示GDF11可能与2型糖尿病心肌变化及心脏缺血/再灌注后心功能降低有关，其机制有待进一步研究。

【关键词】GDF11；2型糖尿病；缺血/再灌注损伤；心肌

糖尿病人群不仅罹患缺血性心脏病（ ischemic heart disease，IHD）的发病率高于正常人群，且糖尿病心肌对缺血损伤易感性增加，其心脏损伤程度及病死率均会进一步显著增加[1，2]。生长转化因子11（growth differentiation fact 11，GDF11），也叫骨形态发生蛋白11（bone morphogenetic protein 11，BMP11），是TGF-β超家族的一员，最近也被证实在心脏保护中发挥积极作用。已有研究证实同属TGF-β超家族成员的GDF-15对缺血或 I/R 引起的心脏损伤具有拮抗作用[3]。然而2型糖尿病心肌变化及心脏缺血/再灌注后心功能降低与GDF11是否相关尚未有研究报道。本实验旨在观察2型糖尿病小鼠心脏GDF11表达情况及心肌GDF11的表达变化与糖尿病心肌缺血/再灌注损伤的关系。

1 材料和方法

1.1 实验动物和材料 选择4周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠，体重14～16g，由第四军医大学实验动物中心提供。抗 GDF11 抗体购自Santa Cruz公司。

1.2 2型糖尿病小鼠模型的建立及分组 40只小鼠随机分为A组（正常对照组，n=20）和B组（糖尿病组，n=20），其中A组给予常规饲料，自由饮水。B组给予高脂饮食（购自中国科学院上海实验动物中心，D12451）喂养，自由饮水。小鼠分别给予相应饲料喂养4周，在第4周末，禁食8 h。B组腹腔注射小剂量链脲佐菌素（STZ，50mg/kg体重，Sigma公司，溶于0.1 mol/L柠檬酸缓冲液中，pH4.4），A组腹腔注射等体积的柠檬酸缓冲液。STZ注射的整个操作在冰浴上进行，保证整个注射过程在15 min内完成。注射后继续各自的饲料喂养4周，在第8周末，小鼠禁食8 h后，用灭菌小剪刀剪尾取血，应用血糖仪测定血糖，血糖≥11.1 mmol/L被认为糖尿病模型成功。饲养过程中保证充足的水和食物，并每天更换鼠笼和垫料一次。B组全部造模成功。

小鼠随机分为4组，每组10只：①正常假手术组（Con+Sham）；②正常缺血再灌注组（Con+MI/R）；③糖尿病假手术组（DM+Sham）；○4糖尿病缺血再灌注组（DM+MI/R）。

1.3 小鼠MI/R 模型的建立 麻醉小鼠，手術暴露心脏，用6-0丝线在小鼠心脏左前降支距根部2～3 mm 处打一活结，造成心肌缺血，待 30 min 后，打开活结进行心肌再灌注。

1.4 心功能检测 每组5只小鼠手术后 24 h利用 Vevo2100小动物超声仪（VisualSonics，Toronto，Canada）检测并计算左室射血分数（LVEF）、左室短轴缩短率（LVFS）等心功能的变化，测量5个心动周期，取平均值作为最后检测数据。

1.5 GDF11 表达量检测 每组5只小鼠手术后 3 h后迅速冻存样本。采用 Western blot 法进行检测，心肌组织用预冷至 4℃ 的 PBS 清洗后移入预冷的裂解液中并剪碎。组织匀浆后 12 000 r/min 4℃ 离心 10 min，取上清。BCA 法测定蛋白浓度。加上样缓冲液并煮沸后得到上样样本，置于-80℃冰箱保存备用。将蛋白样品行 SDS-PGEA 电泳，用湿电转法将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜（ PVDF）上。用含5%脱脂奶粉的TBST溶液室温封闭 2 h。按照分子量将PVDF 裁切分别和一抗一起孵育，4℃ 过夜；用 TBST 摇床漂洗3次（每次8 min），将膜与对应二抗室温一起孵育 2 h，再次用 TBST 摇床漂洗3次（每次8 min）后，滴加ECL发光液，用凝胶成像分析系统进行化学发光检测，并用配套软件（ImageLab）进行分析。

1.6 统计学分析 实验结果以x（_）±SE表示，利用GraphPad Prism 5.0统计软件进行分析，组间比较用LSD-t检验，以P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组心功能的比较 小鼠心肌缺血再灌注 24 h 后超声心动图显示，正常缺血再灌注组（Con+MI/R）与正常假手术组（Con+Sham）相比、糖尿病缺血再灌注组（DM+ MI/R）与糖尿病假手术组（DM+Sham）相比， LVEF 与 LVFS 分别显著下降（均P <0.01）。糖尿病缺血再灌注组（DM+ MI/R）较正常缺血再灌注组（Con+MI/R）心功能明显下降（P <0.01），提示2型糖尿病加重心肌缺血/再灌注心功能损害。

2.2 各组 GDF11 蛋白表达的比较 Western blot 法检测结果显示，正常缺血再灌注组（Con+MI/R）与正常假手术组（Con+Sham）相比、糖尿病缺血再灌注组（DM+ MI/R）与糖尿病假手术组（DM+Sham）相比，GDF11表达显著下调（均P <0.01）。糖尿病假手术组（DM+Sham）与正常假手术组（Con+Sham）相比、糖尿病缺血再灌注组（DM+ MI/R）与正常缺血再灌注组（Con+MI/R）相比GDF11表达显著下调（均P <0.01），提示GDF11可能与2型糖尿病心肌变化及心脏缺血/再灌注后心功能降低有关。

3 讨论

研究表明：2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus， T2DM）患者较非糖尿病患者缺血性心脏病发病率显著提高，且糖尿病患者发生心肌梗死后的病死率更高；合并2型糖尿病时更易诱发心肌缺血再灌注损伤（Myocardial Ischemia/Reperfusion， MI/R），糖尿病可导致心肌细胞凋亡增加，并增加其MI/R损伤的敏感性[1，2]。本实验进一步证实2型糖尿病加重心肌缺血/再灌注心功能损害，与既往研究报道相符合[4，5]。但是，糖尿病患者心肌细胞对缺血性损伤敏感性增加的细胞内信号转导机制仍不完全清楚[6]。

已有研究证实GDF11在心脏保护中发挥积极作用。Lofredo等[5]将年轻小鼠和年老小鼠的脉管系统连接在一起共享血液循环，结果发现年老小鼠的心脏肥大得到了明显的改善。Loffredo等[7]发现，小鼠血液中GDF11水平随衰老会显著下降，且GDF11的降低与老年性心脏肥大的发生密切相关。他们给心脏肥大的老年小鼠连续腹腔注射GDF11 30天后，老年小鼠的心脏肥大状况也明显改善。Loffredo等认为，GDF11通过调节FoxO3和smad2/3等信号通路而发挥心脏保护作用。Olson KA等[8]在2015年发表的一项928名稳定型缺血性心脏病患者参与的研究中发现患者血浆较高水平的GDF11与其心血管事件和死亡率呈明显负相关，提示GDF11可能在缺血心肌损伤及心肌保护中发挥重要作用。但GDF11是否直接参与心脏缺血再灌注损伤保护尚未有研究报道。

本研究结果首次表明：与正常小鼠相比，2型糖尿病小鼠心肌GDF11的表达量下调；I /R 损伤后心肌GDF11 水平显著降低，糖尿病情况下GDF11 水平下降更明显。所以，我们认为 GDF11 在2型糖尿病心肌变化中发挥着重要作用，GDF11可能是引起2型糖尿病患者心肌I/R损伤后心肌损伤加重的关键因素之一，GDF11将可能会成为预防和治疗糖尿病患者缺血性心脏病的潜在治疗靶点蛋白。本研究只是提示GDF11在2型糖尿病小鼠心肌I/R损伤中发挥调控作用，但对于GDF11如何调控糖尿病情况下加重心肌I/R损伤的机制，还有待于我们进一步研究。

参考文献：

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[6] 方颖慧，袁媛，龙村.糖尿病心肌对常规保护措施抵抗机制的研究进展[J].中国体外循环杂志，2013，02：125-128.

[7] Loffredo FS， Steinhauser ML， Jay SM， et al.Growth differentiation factor 11 is a circulating factor that reverses age-related cardiac hypertrophy. Cell 2013；153：828- 39.

[8] Olson KA， Beatty AL， Heidecker B， et al.Association of growth differentiation factor 11/8，putative anti-ageing factor， with cardiovascular outcomes and overall mortality in humans：analysis of the Heart and Soul and HUNT3 cohorts. European Heart Journal 2015；36（48）：3426-34.