土壤中高效解磷菌的鉴定及其对皖南烤烟幼苗生长的影响

汪志宇　岳耀稳

摘要 从皖南地区200多个土壤样品中分离、筛选出4株能降解无机磷的优势菌株GY22-3-2、GY7-3-7、GY13-2-5、GY2-4-2，并通过实验室培养测定其解磷能力，分别为11.92 %、8.25%、7.48%、3.49%。将其接种于烤烟幼苗，考察其对烤烟幼苗生长的影响。结果表明，在充分供应烤烟幼苗氮、钾等其他营养元素的情况下，解磷菌株能够不同程度地发挥解磷效果，在其影响下，烟株各部位鲜重、干重及叶绿素含量较不接菌的对照显著增加，根系活力较对照明显增强，其中，GY22-3-2菌株较其他菌株表现出更强的解磷能力，解磷效果较好。

关键词 烤烟；解磷菌；解磷能力；鉴定；幼苗生长

中图分类号 S572 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）16-0029-02

磷是高等植物生长所必需的大量矿质元素之一，然而土壤中95%以上的磷呈有机（含量约占全磷含量的50%以上）或无机磷化物状态存在，水溶性很低，很难被植物直接吸收利用，只有很少比例的速效态磷能被植物直接利用，从而造成了世界范围内磷素的缺乏。解决这一问题有2条途径：一是增加磷源投入，二是提高难溶性磷的利用率。从农业可持续发展来看，增加磷源投入存在一定的问题，而提高难溶性磷的利用率的潜力则很大，它是对土壤中磷及所施入的磷肥进行活化提高其有效性，走低投入高产出的可持续发展道路。本试验从安徽省皖南地区采集的土样中分离筛选出了4株能降解无机磷的微生物，并进一步纯化鉴定，初步测定了它们的解磷能力，并将其接种于烤烟幼苗，观察测定其对烤烟幼苗生长的促进作用，最终确定具有较高解磷能力的菌株，为进一步研究土壤微生物解磷机制及开发解磷菌株制剂奠定坚实的基础[1-3]。

1 材料与方法

1.1 试验土概况

本试验分离解磷微生物用土采集自安徽省皖南地区的200多个土样；盆栽试验用土来自黄山市徽州区东山村，主要理化性状：pH值6.2～6.7、全氮0.15 g/kg、全磷0.32 g/kg、全钾19.7 g/kg、细菌2.1×106个/g土、放线菌3.5×106个/g土、真菌1×106个/g土、碱解氮24.5 mg/kg、速效磷1.9 mg/kg、速效钾98 mg/kg。

1.2 供试材料

供试烤烟品种为云烟97。供试培养基为分离培养基：解磷菌株分离培养基（液体）（以下简记为P1培养基）配方如下：葡萄糖10 g，硫酸铵0.5 g，磷酸钙10 g，氯化钠0.3 g，氯化钾0.3 g，硫酸镁0.3 g，硫酸亚铁0.03 g，硫酸锰0.03 g，蒸馏水1 000 mL，pH值7.0～7.5，121 ℃灭菌30 min，pH值为6.8～7.3。解磷菌株分离培养基（固体）：琼脂18～20 g，其他同液体培养基。斜面培养基成分与固体培养基相同。

1.3 菌株分离方法

涂布法：取野外采集土样适量，研钵研细，称取10 g粉末加入盛有100 mL无菌水的三角瓶中，25 ℃搖床恒温振荡30 min，取上清液作10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8稀释液，各取0.2 mL该稀释液涂布于平板培养基上，每个浓度重复3皿，28 ℃恒温培养7 d。挑取单菌落转至斜面培养至菌苔长起，置4 ℃冰箱保存，进一步筛选，共得224个菌株。

1.4 解磷能力的测定方法

1.4.1 菌株在固体培养基中解磷能力的测定。观察溶钙圈法：将初筛得到的224个菌株接种于无机磷固体培养基中，倒置于28 ℃恒温箱中培养7 d，观察有无溶钙圈，并根据溶钙圈的大小初步确定解磷效果。

1.4.2 菌株在液体培养基中解磷能力的测定。钼酸铵定磷试剂比色法：将初筛得到的4个菌株GY22-3-2、GY7-3-7、GY13-2-5、GY2-4-2分别接种在灭过菌的P1液体培养基中，用不接菌的液体培养基作对照，28 ℃往复摇床144 r/min培养7 d。取过滤后的培养液测定培养液中可溶性磷的含量。

1.5 解磷菌株对烟草幼苗生长的促进作用试验设计

采用盆栽法进行研究。试验地点：皖南烟叶公司黄山烟叶经理部试验基地；花盆规格12 cm×12 cm；栽培环境：温室中；烟苗苗龄30 d。每株烟基施K2SO4 4 g、NH4NO3 2.5 g、缓苗后追施K2SO4 2 g、NH4NO3 1.5 g。

本试验共设5个处理，分别是GY22-3-2、GY7-3-7、GY13-2-5、GY2-4-2、不接菌作对照（CK），3次重复。在烟苗移栽后第4天（基本缓苗）接种28 ℃ 144 r/min摇床培养7 d的菌株培养液和不接菌的培养液CK，每株20 mL。

接种后每10 d测1次株高，30 d后测烟株根、茎、叶鲜重、干重。根系活力采用TTC染色法[4-6]。叶绿素含量用研磨法。

1.6 数据处理方法

用DPS数据分析软件对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 菌株在固体培养基中分解Ca3（PO4）2的能力

从表1可以看出，CK各项指标均为0，说明在无微生物存在的情况下，Ca3（PO4）2在试验条件下无释放。而菌株GY22-3-2、GY7-3-7、GY13-2-5、GY2-4-2在以Ca3（PO4）2为唯一磷源的平板中都能产生透明圈，说明这4个菌株都能一定程度地分解Ca3（PO4）2。而在菌株GY22-3-2的周围出现了较明显的透明圈，说明在以Ca3（PO4）2为唯一磷源的固体培养基中，菌株GY22-3-2的解磷能力最强，GY7-3-7、GY13-2-5菌株次之，GY2-4-2较差。

2.2 菌株在液体培养基中分解Ca3（PO4）2的能力endprint

从图1可以看出，经过7 d的摇床培养，解磷菌株表现出不同的解磷能力。其中，菌株GY22-3-2的解磷能力最强，其效率高达11.92%；GY7-3-7次之，GY2-4-2较弱。其解磷能力较CK高86.25%～95.97%。

2.3 不同解磷菌株对烤烟幼苗生长的促进作用

2.3.1 对烤烟幼苗株高的影响。由于土壤中含有一定的速效磷，这部分磷在一定时间内足以供给烤烟幼苗生长对磷素的需求。因此，接种后10 d，各个处理间烟苗生长的差异不显著。随着烟苗的生长，土壤中的速效磷被耗尽，这时解磷菌株便不同程度地发挥解磷作用，将土壤中难溶性磷分解为可溶性的磷，供烟苗生长利用。从图2可以看出，在固体和液体培养基中均表现良好解磷效果的GY22-3-2菌株始终处于最好水平，且随时间的推移，解磷效果不断快速增加，而表现较差的GY2-4-2菌株，虽然随时间推移也在增加，但增加的幅度明显没有GY22-3-2高。说明在试验条件下解磷效果越好的菌株，对烟苗生长的促进作用越明显。

2.3.2 对烤烟幼苗根、茎、叶鲜、干重的影响。从图3可以看出，对根、茎、叶鲜重的影响总的表现为GY22-3-2>GY7-3-7>GY13-2-5> GY2-4-2>CK。从图4可以看出，不同解磷菌株对烟苗干重的影响与对鲜重的影响大致相同，对根、茎、叶干物质增加量的影响都是GY22-3-2>GY7-3-7>GY13-2-5> GY2-4-2>CK，施入解磷菌的处理与CK相比达显著水平。烟株对氮、磷、钾等各种营养元素的吸收存在一定的平衡关系，因此，在烟株生长过程中，其中任意一种元素的缺乏必然影响烟株对其他物质的吸收。在氮、钾等供应充足的情况下，解磷效果较强的处理，由于解磷菌分解了大量的难溶性磷酸盐，土壤中植物可利用的有效磷的含量大大增加，促进了烟株对其他物质的吸收，进而促进烟株的生长。

2.3.3 对烟草幼苗叶绿素含量的影响。从表2可看出，不同解磷菌株对烟苗叶绿素及类胡萝卜素含量的影响比较明显，处理GY22-3-2的各项指标均显著高于其他处理，CK最差。一方面说明，与CK相比，各菌株均能在一定程度上改善土壤有效磷的供应状况，促进烟株幼苗叶片叶绿素的形成；另一方面可以很清楚地看出，在供试菌株中，GY22-3-2菌株对叶绿素的影响明显好于其他菌株，从对叶绿素含量的影响上再次证明该菌株的高解磷能力。

2.3.4 不同解磷菌株对烟草幼苗根系活力的影响。从图5可以看出，在相同的氮、钾水平条件下，不同的菌群接种到土壤中对烟株根系活力有不同的影响，解磷效果较好的菌株GY22-3-2其烟苗的根系活力也较强，其原因可能是解磷能力较强的菌株分泌出较多的磷酸酶，使土壤中难溶性磷酸盐释放出来，显著增强根系周围的酶活性，进一步促进了根系的发育，从而大大增强了烟苗的根系活力。

3 结论与讨论

试验结果表明，在以Ca3（PO4）2为唯一磷源的培养基中，供试4个菌株都能不同程度地分解Ca3（PO4）2，从而产生透明圈。在充分供应氮、钾等其他元素的情况下，解磷菌剂能够促进烟草幼苗的生长发育，对叶绿素含量、干物质累积量有很大影响，尤其能够促进烤烟幼苗侧根的发生，使烟苗根系活力增强，提高烟苗素质。GY22-3-2菌株无论是在实验室条件下培养基中的解磷效果，还是在土壤条件下对烤烟幼苗生长的促进效果上，均明显好于其他菌株。在测定菌株分解Ca3（PO4）2的能力的过程中，发现在平板中产生透明圈较大的菌株GY22-3-2，在液体培养基中的解磷能力也最强，但是，这仅仅说明该菌株对该状态的Ca3（PO4）2分解能力强，对土壤中存在的Ca8-p、Ca10-p、Fe-p和Al-p的分解能力是否强还需要进一步研究。虽然本试验中解磷菌对烟苗生长的促进作用比较明显，在一定程度上能够说明解磷菌在土壤中的解磷效果较好，但是，因为本试验是在可调控温湿度的大棚中进行，且栽培时间较短，存在很多偶然性。若将其应用于大田生产，因其环境条件可人为控制因素不大，尤其在烟草生长季节，一般情况下降雨量较多，且土壤中固有的大量微生物与解磷菌存在激烈的竞争作用，这些原因都会导致解磷菌的解磷能力降低甚至消失，或者使解磷菌死亡。另外，本试验只分离出具有解磷能力的微生物，而没有分析鉴定其分类，这有待进一步研究，确定其类别和生长习性，以便为解磷菌在土壤中最大程度地发挥解磷效果的环境条件的确定提供理论依据。

4 致谢

感谢云南省烟草科学研究所提供这次实习机会！在试验操作过程中，得到了云南省烟草科学研究所高家合、廖德智、张红艳3位老師的大力支持；同时，张英、马方磊等几位同学也提供了许多帮助。在此次论文撰写过程中，年夫照博士对本人进行了悉心指导，在此一并致以最诚挚的谢意！

5 参考文献

[1] 徐俊兵.扬州市土壤有机质和速效磷钾的分布研究[J].土壤，2004，36（1）：99-103.

[2] 华中农业大学，南京农业大学.微生物学[M].北京：农业出版社，1985.

[3] 诸葛健，王正祥.工业微生物实验技术手册[M].北京：中国轻工业出版社，1994.

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[5] 李晓举，吴风光，王豹祥，等.一株烤烟根际解磷细菌的鉴定及其在烤烟生产中的应用[J].河南农业科学，2011（6）：66-70.

[6] 张雪芹，彭克勤，王少先，等.缓释肥料对烤烟旺长期解磷细菌的影响[J].湖南环境生物职业技术学院学报，2009（2）：6-9.endprint