双向电泳技术筛选鉴定冬虫夏草中指标性蛋白质研究△

童芯锌，王艺璇，陈璐，邱乙，万德光，任艳，彭成，沈才洪，李军德，国锦琳,*

(1.成都中医药大学 中药材标准化教育部重点实验室，四川 成都 611137；2.泸州老窖博士后工作站，四川 泸州 646000；3.中国中医科学院 中药资源中心，北京 100700)

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双向电泳技术筛选鉴定冬虫夏草中指标性蛋白质研究△

童芯锌1，王艺璇1，陈璐1，邱乙1，万德光1，任艳1，彭成1，沈才洪2，李军德3，国锦琳1,2*

(1.成都中医药大学 中药材标准化教育部重点实验室，四川 成都611137；2.泸州老窖博士后工作站，四川 泸州646000；3.中国中医科学院 中药资源中心，北京100700)

对名贵中药材冬虫夏草及其伪品建立稳定可靠的双向电泳鉴定方法。正品冬虫夏草中共同表达的蛋白质斑点为88个，伪品稳定差异表达的蛋白质斑点为21个，提示可作为下一步冬虫夏草鉴定的指标性组分。进一步质谱分析与NCBI数据库比对表明：6种蛋白仅来自于菌数据库，9种蛋白仅来自于昆虫数据库，12种蛋白仅来自于全库，3种蛋白昆虫和菌的数据库均能检索，1种蛋白仅来自于菌数据库和全库，提示下一步可进行冬虫夏草指标性蛋白质功能研究，为冬虫夏草有效成分研究奠定基础。

冬虫夏草；双向电泳；指标性蛋白质；功能蛋白质

冬虫夏草为麦角菌科冬虫夏草菌Ophiocordycepssinensis(Berk.)Sacc.寄生在鳞翅目蝙蝠蛾科昆虫幼虫上形成的幼虫尸体及子座的复合体[1]，属国家二级保护名贵药材。由于其野生资源分布区域狭窄，目前尚无成熟人工培植技术，药材需求量大，市场供求严重失衡。加之全球变暖、雪线上移，蝙蝠蛾大量死亡，产量逐年减少，资源缺乏，故极为珍贵[2-3]。全世界已报道的虫草属真菌有400多种，我国有60多种，可寄生于9个目昆虫的幼虫、蛹和成虫，但中华人民共和国药典收载的冬虫夏草其寄主是产于我国青藏高原特殊高寒生境的蝠蛾幼虫，因而市场掺伪、掺假现象时有发生[4-5]，严重影响了市场流通和临床安全[6]。目前，鉴别冬虫夏草及其混伪品多采用外观、显微、理化等方法与技术，由于冬虫夏草品种繁多，种间相似度较高，凭借外观或经验不能很好地进行鉴别。尤其是将其加工成粉末产品，常规鉴定方法基本不能有效鉴定，因此，亟需建立一种全新而可靠的冬虫夏草鉴定方法[7-8]。

冬虫夏草含量最高的一类化学成分即为蛋白质，约25%～32%。作为初级代谢产物的蛋白质(肽)，在物种体内具有稳定的含量和物种特异性，可以作为物种鉴定的有效依据，目前在中药材鉴定中未能受到重视[9-14]。双向电泳技术可将数千种蛋白质同时分离，且重现性高。本研究首次应用蛋白组学技术寻找到正品冬虫夏草中的特异性蛋白质(多肽)，作为冬虫夏草的指标性组分，开拓了新的鉴定思路，为后续动物药材和果实种子类药材的鉴定进行了有益的探索。

1 材料

1.1药材

药材均为实验室采集或收集，经国锦琳教授鉴定后留样成都中医药大学中药材标准化教育部重点实验室。

表1 虫草类药材信息表

表1(续)

1.2试剂

丙烯酰胺、N，N′-甲叉丙烯酰胺、Tris碱、甘氨酸、碘乙酰胺、四甲基乙二胺(TEMED)、十二烷基硫酸钠(SDS)、尿素、过硫酸铵、BSA均为Sigma产品；IPG胶条(17cm，pH3～10)、两性电解质(Bio-lyte，pH3～10)、Readyprep2-Dcleanup试剂盒、矿物油购自Bio-rad公司；DTT为Merck产品；其余化学试剂均为分析纯；水为超纯水。

2 方法

2.1样品制备

采用本实验室建立的方法进行样品前处理。

制备样品采用Bradford法[16]对样品蛋白液进行含量测定，上样缓冲液稀释至2μg·μL-1。

2.2双向电泳(2-DE)

采用17 cm、pH3～10 IPG预制胶条，被动水化上样，上样量为600 μg(上样体积300 μL)[17]。

2.3染色

电泳结束后，采用BlueSilver染色法进行凝胶染色[18]。

2.4扫描及图像分析

染色后采用GEImageScannerIII投射扫描记录，Imagemaster7.0双向电泳分析软件进行图谱分析。

2.5胶内蛋白质酶解

胶内蛋白质的脱色、烷基化、脱水消化、萃取按照文献[17]的方法进行。

2.6质谱分析

取10uL样品上清液进行质谱仪分析。利用MASCOTServe软件检索数据库鉴定信息，得质谱结果。

3 结果

3.1双向电泳方法学研究

优化双向电泳方法后，取冬虫夏草适量制样后，在同等条件下进行2-DE，重复3次。BlueSilver染色后，采用GEImageScannerIII扫描仪透射扫描凝胶，Imagemaster7.0软件分析自动点检测，平均检测蛋白点数为(827±34)个。见图1。以其中一块胶为参比胶进行3块凝胶间的蛋白质点匹配，平均匹配点数为711个，匹配率为86%。选择3块凝胶中相互匹配且分辨清晰的50个蛋白点，选择位置偏中间的一个点为原点，以参比胶为参考位置进行测量，发现在等点聚焦(IEF)方向上其平均偏差为(1.64±0.23)mm，在SDS方向上其平均偏差为(2.09±0.36)mm。表明所建立的2-DE方法对冬虫夏草蛋白质具有良好的分辨率和重现性。

注：a、b、c为三次重复。图1 双向电泳重复性试验图谱(n=3)

3.2冬虫夏草共有蛋白分析

采用Imagemaster7.0双向电泳分析软件进行图谱分析，将所有冬虫夏草样品设为一组，以样品1图谱为参考胶，进行组内匹配分析。见图2。以各图谱间匹配蛋白点为共同点，经图谱分析得到共同表达蛋白点88个。

图2 正品冬虫夏草共有蛋白质斑点检测图

3.3冬虫夏草指标性蛋白质(差异蛋白质)研究

利用Imagemaster7.0软件对各产地冬虫夏草2-DE图谱进行匹配分析后，建立平均凝胶图作为参比胶，各虫草2-DE图谱为分析胶组间匹配，进行差异表达分析，以平均凝胶图谱中存在而不同组间无法匹配的蛋白点为差异点。经过分析后得到差异表达蛋白点21个。

理论上这21种蛋白质均可作为冬虫夏草鉴定的指标性组分，从实际操作上可选择丰度较高的蛋白质作为其指标性蛋白质进行鉴定研究。见图3。

图3 21个指标性蛋白质(差异蛋白质)图谱

3.4质谱分析结果

将获得的21种蛋白质N-端序列与NCBI蛋白质数据库中进行比对。6种蛋白仅来自于菌数据库，9种蛋白仅来自于昆虫数据库，12种蛋白仅来自于全库，3种蛋白昆虫和菌的数据库均能检索，1种蛋白仅来自于菌数据库和全库。见表2～4。

表2 蛋白质检索来源

表3 21个指标性蛋白质按等电点范围分类

表4 21个指标性蛋白按分子量范围分类

4 讨论

首次采用高分辨率2-DE技术对不同产地冬虫夏草和其他种虫草进行差异蛋白组学研究，建立各种虫草蛋白质双向电泳图谱，比对冬虫夏草与其他种虫草蛋白质表达的差异，验证得到21个冬虫夏草指标性蛋白质。课题组后期将继续增加冬虫夏草及混伪品样本量，以及使用不同pH范围IPG胶条获得更高分辨率电泳图谱，对差异蛋白斑点进行反复验证。2-DE对分离低丰度蛋白、极酸极碱蛋白、极大(>200 kD)、极小蛋白(<10 kD)以及难溶蛋白，如膜蛋白等有局限性[19]，同时高丰度蛋白干扰低丰度蛋白检出率，掩盖分子量相似的低丰度蛋白质，限制其装载容量，同时影响聚焦效果[20]。本课题2-DE检出可分析斑点平均为(537±25)个，且功能性蛋白质大多属于低丰度蛋白，可预先使用亲和层析等方法除去部分高丰度蛋白，将获得分辨率更高、蛋白质信息更加丰富的电泳图谱，为后续分离更多功能性蛋白质奠定基础。

差异斑点大多分布在pH 4.5～6.5，分子量20～50 kD，15～25 kD范围内蛋白质仅3种，提示可选择低分子量蛋白质进行下一步制备。

6种蛋白仅来自于菌数据库，9种蛋白仅来自于昆虫数据库，12种蛋白仅来自于全库，3种蛋白昆虫和菌的数据库均能检索，1种蛋白仅来自于菌数据库和全库。可能为冬虫夏草菌在浸染蝙蝠蛾科蝠蛾属昆虫幼虫过程中形成的特殊产物，对深入了解冬虫夏草菌特异性浸染机制、冬虫夏草特殊药理作用相关蛋白质具有重要意义。提示后期可针对筛选得到的具生物活性差异蛋白来源选取相应冬虫夏草子座或虫体。

本研究首次利用蛋白组学技术筛选到冬虫夏草特有的21种蛋白质，下一步可以作为指标性组分进行鉴定研究与实践。动物药及种子果实类中药蛋白质含量丰富，在现有鉴定方案难以突破的前提下，尝试蛋白质组学的高通量筛选技术无疑是一种有意义的尝试。

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StudyonCharacteristicProteinsandIdentificationofOphiocordycepssinensisUsing2-DElectrophoresis

TONG Xinxin1，WANG Yixuan1，CHEN Lu1，QIU Yi1，WAN Deguang1，REN Yan1，PENG Cheng1，SHEN Caihong2，LI Junde3，GUO Jinlin1,2*

(1.Key Laboratory of Standardization of Chinese Medicine，Ministry of Education，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu，611137，China；2.LuzhouLaoJiao Co.，Ltd.，Luzhou，646000，China；3.National Resource Center for Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing，100700，China)

The study is aimed to establish an efficient two-dimensional gel electrophoresis protocol for proteomic studying ofOphiocordycepssinensis.Using two-dimensional electrophoresis，a proteomic analysis ofO.sinensisfrom different areas and other Cordyceps fungi were compared.88 kinds of proteins inO.sinensiswere found.Compared with other Cordyceps fungi，21 kinds of characteristic proteins spots inO.sinensiswere found.These indicated that the 21 kinds of proteins were able to be used to authenticateO.sinensisfrom other Cordyceps fungi.Then further analysis of the proteins Mass Spectra Database of NCBI，6 kinds of proteins came from the fungi database，6 kinds of proteins from insect database，12 kinds of proteins from the total database，3 kinds of proteins were found both in insect database and fungi database，1 kinds of proteins was found in the fungi database and total database.These indicate that further study is needed for some function protein.

Ophiocordycepssinensis；characteristic proteins；2-D electrophoresis(2-DE)；function protein

国家自然科学基金(30801522，81373920)

] 国锦琳，博士，教授，研究方向：名贵中药资源与鉴定；Tel：(028)85214048，E-mail：guo596@163.om

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.1.005

2016-09-02)

*[